猪圆环病毒2型抗体检测间接ELISA方法的建立

用纯化的重组猪圆环病毒2型(PCV2)ORF2蛋白作为包被抗原,对各种条件进行优化(如抗原的包被、血清及酶标二抗作用时间、底物的选择等),建立了检测猪圆环病毒2型(PCV2)抗体的间接酶联免疫吸附试验(ELISA)的方法。结果显示,重组抗原最适包被浓度为0.5mg/L,最适包被条件为4℃过夜,血清稀释度1∶160,酶标二抗工作浓度1∶7500,待检测血清和酶标二抗的反应时间均为37℃,45min,底物37℃显色10min。阻断试验表明,建立的间接ELSA对PCV2抗体具有很好的特异性。板内和板间重复试验显示,同1份血清板内各孔的变异系数均值为2.78%,板间同一份血清D值变化不大,表明重复性好。

4种因素对NK细胞杀伤活性的影响

为了探讨效应细胞与靶细胞的比例(效靶比)、孵育时间、显色时间以及小牛血清浓度对NK细胞杀伤活性的影响,采用乳酸脱氢酶释放法来测定不同因素对NK细胞杀伤活性的影响,结果表明,最佳效靶比和孵育时间分别为50∶1和2 h。在最优效靶比及孵育时间的基础上,显色0.5 h,小牛血清浓度为50 mL/L时NK细胞活性最高,证明4种因素对NK细胞杀伤活性均有不同程序的影响。

犬、猪转移因子对犬淋巴细胞体外转化增殖影响的比较研究

无菌采取犬抗凝血,分离淋巴细胞并制备成不同浓度。应用正交试验,探讨不同浓度淋巴细胞、植物血凝素P(PHA-P)、犊牛血清(FCS)对淋巴细胞增殖的影响。在此基础上,研究不同浓度犬、猪转移因子(transferfactor,TF)对犬淋巴细胞增殖的影响,增殖的结果用MTT法测定。结果表明,当犬淋巴细胞浓度为5×106个/ml,PHA-P为12.5μg/ml,FCS为10%时,淋巴细胞增殖效果最佳。在最佳培养条件下,犬、猪TF浓度在0.195￣25mg/ml时,对淋巴细胞转化增殖均有促进作用,但犬、猪TF单独或与PHA-P共同作用时对淋巴细胞增殖的最佳刺激浓度均为1.56mg/ml,且犬、猪TF单独作用于淋巴细胞的效应明显优于与PHA-P的协同作用。结果证实,同源或异源TF对犬淋巴细胞增殖有良好的刺激效果,同时研究结果为异源TF在临床上应用于犬病毒性疾病的防治提供了实验依据。

猪转移因子对犬淋巴细胞转化增殖的影响

无菌采取犬抗凝血,分离淋巴细胞并制备成不同浓度.应用正交试验,探讨不同浓度淋巴细胞、植物血凝素(PHA-p)、犊牛血清(FCS)对淋巴细胞增殖的影响.在此基础上,研究不同浓度猪转移因子(transfer factor,TF)对犬淋巴细胞增殖的影响,增殖的结果用MTT法测定.试验结果表明,当犬淋巴细胞浓度为5×106个/ml,PHA-P为12.5μg/ml,FCS为10%时,淋巴细胞增殖效果最佳.在最佳培养条件下,猪TF浓度在0.195～25mg/ml时,对淋巴细胞转化增殖均有明显促进作用,猪TF单独或与PHA-P共同作用时对淋巴细胞增殖的最佳刺激浓度均为1.56mg/ml,且猪TF单独作用于淋巴细胞的效果优于与PHA-P的协同作用.试验结果证实,异源TF对犬淋巴细胞增殖有良好的刺激效果,同时本研究结果为异源TF在临床上应用于犬病毒性疾病的防治提供了试验依据.

猪圆环病毒Ⅱ型Cap蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

以纯化复性的猪圆环病毒Ⅱ型（PCV2）Cap重组蛋白作为免疫原，按常规方法免疫BALB／c小鼠，取其脾细胞与SP2／0细胞融合，经间接ELISA筛选，获得了3株分泌PCV2-Cap蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞，分别命名为1C7A4、4F3F5和4G8F7，其染色体平均数为98～103，间接ELISA检测3株细胞培养上清效价分别为1：3125、1：3125、1：15625，小鼠腹水效价分别为1：390000、1：390000、1：1950000。ELISA结果显示，1C7A4、4F3F5和4G87F仅与融合表达的PCV2-Cap蛋白反应，而与PET-32a载体表达的蛋白不反应。相加ELISA结果显示3株单克隆抗体对应两个不同的病毒抗原位点。间接免疫荧光结果显示，1C7A4、4F3F5和4G8F7能与PCV2发生反应，而不与PCV1发生交叉反应。结果表明所获得的3株单抗是PCV2型特异性的，为PCV1和PCV2鉴别诊断方法的建立奠定了基础。

猪圆环病毒2型感染裸鼠及BALB/c小鼠的研究

用猪圆环病毒2型(PCV2)经腹腔注射BALB/c小鼠及裸鼠各15只,每隔2周1次,共感染3次。BALB/c小鼠初次、再次感染后均未出现明显的临床症状,仅有2只小鼠出现病理变化;从血清中可检测到PCV2核酸及其ORF2抗体;同时淋巴细胞增殖反应显著增强,NK和CTL细胞杀伤率显著升高;CD4+、CD8+、CD3+T淋巴细胞及CD19+B淋巴细胞数量显著减少。裸鼠也未出现明显的临床症状,从血清中可检测到PCV2核酸,但未检测到PCV2 ORF2抗体;除NK细胞杀伤率显著升高外,其余免疫学指标无显著改变。结果表明,BALB/c小鼠比裸鼠对PCV2易感,各项免疫学指标变化与PCV2感染猪一致,但不表现临床症状,仅个别BALB/c小鼠出现病理变化,说明BALB/c小鼠对PCV2不如猪易感。

猪圆环病毒2型DNA疫苗对小鼠的免疫效果

【目的】构建一种猪圆环病毒2型DNA疫苗,并对其免疫效果进行了研究。【方法】将表达猪圆环病毒2型ORF2基因的1套真核表达元件系统克隆插入到质粒载体pMD-18T,构建成pMD-18T-ORF2,转入E.coliDH5α,提取质粒,经肌肉注射途径对Balb/c小鼠分别在第1,14和28天进行免疫,用生理盐水代替pMD-18T-ORF2进行相同操作,作为对照组,通过监测免疫小鼠体液免疫和细胞免疫的状况,评估分析pMD-18T-ORF2免疫的效果。【结果】初次免疫后小鼠血清中特异性抗体水平持续升高,在第14天达到峰值,加强免疫抗体水平无显著变化;试验组脾淋巴细胞体外增值能力较对照组低(P<0.01);免疫pMD-18T-ORF2的小鼠脾脏NK细胞杀伤活性极显著高于对照组(P<0.01);试验组小鼠脾脏中Th细胞含量与对照组小鼠无显著差异(P>0.05),Tc细胞含量显著高于对照组(P<0.05),B细胞含量较对照组有所减小,但差异不显著(P>0.05)。【结论】构建的pMD-18T-ORF2对小鼠能产生相应的免疫反应,且细胞免疫的效果较体液免疫更显著,非特异性免疫亦有提高。

猪圆环病毒2型ORF2基因的原核表达

【目的】构建猪圆环病毒2型(PCV2)ORF2原核表达质粒载体,高效重组表达PCV2壳蛋白Cap,为进一步建立PCV2 ELISA的检测方法及Cap蛋白单克隆抗体的制备研究奠定基础。【方法】根据猪圆环病毒2型ORF2基因序列设计带有BamHⅠ、HindⅢ酶切位点的引物,进行ORF2的PCR体外扩增。用扩增的ORF2基因构建pMD18-T-ORF2质粒,经测序检测正确后,与pET-32a(+)连接获得原核表达重组质粒pET-32a-ORF2。重组质粒pET-32a-ORF2转化BL21-ΔE3后用IPTG诱导表达,对获得的纯化表达产物进行了SDS-PAGE电泳、Western blot检测。【结果】PCR扩增得到了预期580 bp的目的基因,连接载体后经测序完全正确;pET-32a-ORF2在BL21-ΔE3得到高效表达,获得以包涵体形式存在的体外重组原核表达PCV2 Cap蛋白;Western blot检测结果表明,所得到的蛋白能够识别PCV2多克隆抗体。【结论】重组质粒pET-32a-ORF2在BL21-ΔE3高效表达重组PCV2 Cap蛋白,且具有免疫学生物活性。

犬转移因子对犬淋巴细胞体外增殖的影响

无菌采取犬抗凝血,分离并制备不同浓度外周血单个核细胞(PBMC)悬液。应用正交试验,测定植物血凝素,犊牛血清对不同浓度PBMC增殖的影响。用 MTT法测定不同浓度犬转移因子(TF)对 PBMC 增殖的影响。结果表明,当 PBMC 为 5×109 个/L,植物血凝素为 12. 5 mg/L, 犊牛血清为100 mL/L,PBMC 增殖效果最佳。TF 浓度在0.39 g/L^100 g/L时,对 PBMC转化增殖均有促进作用,在浓度为 1.56 g/L时促淋转效果最佳。且TF单独作用于 PBMC的效应明显优于PHA P的协同作用。TF对 PB MC有良好的刺激增殖效果。

猪圆环病毒2型ORF2和ORF1-2串联基因重组腺病毒对小鼠的免疫效果

为了研究含有猪圆环病毒2型(porcine circovirus type2,PCV2)基因的重组腺病毒作为基因工程疫苗的潜在应用价值,利用本实验室构建的PCV2的ORF2和ORF1-2串联基因的重组腺病毒对小鼠进行了免疫并对其免疫效果进行了研究。分别用表达ORF2和OFR1-2基因的重组腺病毒Ad-ORF2、Ad-ORF1-2经肌肉途径免疫Balb/c小鼠,对免疫后小鼠的血清抗体和脾淋巴细胞中各细胞亚群的比例及其增殖反应、自然杀伤活性和特异性杀伤活性进行了检测和比较。结果表明,用表达ORF2基因和ORF1-2串联基因的重组腺病毒Ad-ORF2、Ad-ORF1-2经肌肉途径免疫Balb/c小鼠后,随着免疫次数的增加,小鼠产生的针对PCV2ORF2基因的特异性抗体水平不断升高,第3次免疫后2周达到最高,但第3次免疫后4周有所下降;免疫重组腺病毒的试验组小鼠的脾淋巴细胞增殖活性、CTL杀伤活性和NK细胞杀伤活性与免疫空载体的对照组和免疫PBS的对照组比较均有显著的差异(P<0.05)。本研究为PCV-2基因工程疫苗的深入研究及应用奠定了基础。

MTT法测定猪TF对犬淋巴细胞转化增殖的研究

无菌采集犬抗凝血,分离淋巴细胞并制备成不同浓度。应用正交试验,探讨不同浓度淋巴细胞、犊牛血清(FCS)、植物血凝素(PHA-P)对淋巴细胞增殖的影响。在此基础上,研究不同浓度猪转移因子(transferfactorTF)对犬淋巴细胞增殖的影响。结果表明:在犬淋巴细胞浓度为5×106个/mL,FCS为10%时,PHA-P为12.5μg/mL时,淋巴细胞增殖效果最佳。在最佳培养条件下,猪TF浓度在0.195～25mg/mL时,对犬淋巴细胞转化增殖均有明显促进作用,但猪TF单独或与PHA-P共同作用时对淋巴细胞增殖的最佳刺激浓度均为1.56mg/mL,且猪TF单独作用于淋巴细胞的效应优于与PHA-P的协同作用。试验结果证实,猪TF对犬淋巴细胞增殖有良好的刺激效果。

探究倾斜摄影测量技术在不动产测绘中的应用

随着城市化进程的加速和不动产需求的不断增长,不动产测绘成为一个日益重要的领域。而倾斜摄影测量技术的出现,为不动产测绘提供了一种效率更高、精度更高的解决方案。倾斜摄影测量技术是指通过将相机倾斜布设在飞机、直升机或无人机上,进行快速、连续的航测拍摄。这种新兴技术具有高速、高密度的数据采集能力,能够快速生成高精度、真实感强的三维影像,因此在不动产测绘中有着广泛的应用前景。本文将探究倾斜摄影测量技术在不动产测绘中的应用,以期为相关人员提供参考。

慢性乙型肝炎病毒感染者细胞免疫功能与血清HBV DNA的关系

目的探讨HBV DNA水平对慢性HBV感染者特异性细胞免疫功能的影响。方法以HBV核心抗原为刺激物,采用酶联免疫斑点测定法检测表面抗体阳性的HBV感染者(A组)、e抗原阳性的慢性HBV携带者(B组)、e抗原阴性的慢性HBV携带者(C组)3类研究对象的IFNγ分泌细胞数量。同时,采用流式细胞术对A、B、C3组分别进行T淋巴细胞亚群及调节性T细胞(regulatory T cells,Treg)检测,并分别用荧光定量PCR仪和全自动生化分析仪对3组的血清HBV DNA水平及AST、ALT水平进行检测。结果 A组与B、C组相比,斑点形成细胞(spot forming cells,SFCs)平均数/106外周血单核细胞明显减少(P=0.000、0.022),C组SFCs平均数显著多于B组(P=0.000)。FACS检测结果表明,A组CD4+T细胞数量及CD4/CD8显著高于B、C组,而B组Treg数量显著高于A、C组。B组HBV DNA水平最高,A组AST/ALT比值显著低于B、C组。结论 HBV感染者机体免疫状态的改善有利于清除病毒,降低血清HBV DNA水平,使疾病的转归较好,这也为慢性乙型肝炎的免疫治疗提供了理论依据。

IFN-γ与IL-12诱导CIK细胞生物学活性的比较研究

探讨IFN-γ与IL-12分别对细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine-induced killer,CIK)的体外扩增速度、细胞免疫表型和杀伤活性的影响。分别以传统的IFN-γ、CD3 mAb、IL-2和IL-1α以及IL-12、CD3 mAb、IL-2和IL-1α为诱导剂制备CIK细胞,直接活细胞计数法比较两者的扩增速度,流式细胞仪检测比较两组细胞的免疫表型,LDH法比较两者对K562细胞株的杀伤活性。结果:两种CIK细胞的增殖速度无显著性差异,但IL-12启动的CIK细胞体外扩增时存活时间比常规CIK细胞长,并且其CD3+CD8+及CD3+CD56+细胞显著高于常规CIK细胞(P<0.05),CD3+CD4+和CD4/CD8显著低于常规CIK(P<0.05),并且其体外对K562的非特异杀伤活性在效靶比为40∶1时显著高于常规CIK。IL-12诱导扩增的CIK中效应细胞比例显著增加,同时抑制性T细胞比例降低,且体外该CIK细胞的杀伤能力较常规CIK好。故IL-12取代IFN-γ对CIK进行预刺激可增强CIK细胞的生物学活性。

ELISPOT及FACS在慢性乙型肝炎病毒感染者细胞免疫功能检测中的应用

为探讨HBV感染者特异性细胞免疫功能的差异,选取以流感多肽刺激健康人外周血单个核细胞(PBMC),采用ELISPOT法检测其PBMC中IFN-γ分泌细胞的数量。在以流感多肽为刺激物建立的流感质控细胞库的调控下,以HBV核心抗原为刺激物,检测表面抗体阳性的HBV感染者(A组)、e抗原阳性的慢性HBV携带者(B组)、e抗原阴性的慢性HBV携带者(C组)三类研究对象的IFN-γ分泌细胞数量。同时,采用FACS方法对A、B、C组分别进行T淋巴细胞亚群及调节性T细胞(Treg)检测。发现A与B、C组相比,斑点形成细胞数(SFC)/106PBMC明显减少(P=0.000及P=0.022),C组斑点形成细胞数显著多于B组(P=0.000)。FACS检测结果A组CD4+T细胞数量及CD4/CD8比值A组显著高于B、C组,而Treg数量B组显著高于A、C组。表明通过ELISPOT及FACS对乙肝病毒感染者外周血T细胞进行数量上和功能上的研究,能够深入了解体机体的免疫状态,从而为临床治疗及判定疾病的发展、转归提供理论依据。