基于喜树碱生物合成的喜树内生菌及其关键酶基因克隆

以喜树内生菌为研究对象,经发酵培养后提取喜树碱及其衍生物,采用HPLC法对发酵液中喜树碱及其衍生物进行定性检测,获得能够产生喜树碱(CPT)及10-羟基喜树碱(HCPT)的喜树内生菌。通过对喜树碱生物合成途径的研究,选取10-羟基香叶醇羟化酶(G10H)、10-羟基香叶醇脱氢酶(HGO)、色氨酸脱羧酶(TDC)和异胡豆苷合酶(STR)4个关键酶基因作为研究对象,设计特异性引物,克隆目的基因。提取喜树RNA,经反转录合成cDNA,同时提取喜树内生菌DNA。分别以植物cDNA和内生菌DNA作为模板,筛选鉴定喜树碱合成途径的关键酶基因G10 H、HGO、TDC和STR并与喜树关键酶基因进行比较,初步解析喜树碱代谢途径,为喜树内生菌发酵合成喜树碱及其衍生物提供理论依据。

VIGS沉默CaCYC1基因对喜树叶片中喜树碱合成的影响

喜树是一种具有药用价值的木本植物,其主要次级代谢产物喜树碱具有良好的抗癌功效。本研究主要通过病毒诱导的基因沉默(virus induced gene silencing,VIGS)技术对喜树碱生物合成途径中的关键酶基因CaCYC1环烯醚萜合酶(Camptotheca acuminata iridoid synthase,CaCYC1)进行瞬时沉默,进而研究该基因对喜树碱生物合成的影响。以喜树叶片总RNA为模板,通过RT-PCR技术克隆CaCYC1基因片段并构建TRV-VIGS重组质粒,转化农杆菌GV3101后侵染喜树叶片,培养20 d后利用qRT-PCR与HPLC技术分析沉默对CaCYC1基因转录水平及喜树碱合成的影响。结果表明:与对照组相比,实验组中CaCYC1基因的相对表达量显著下降49%,叶片中喜树碱的积累量显著下降35%。上述结果表明,本研究所构建的由TRV介导的VIGS体系可有效沉默内源基因的表达,CaCYC1基因可正向调控喜树叶片中喜树碱的生物合成。