表达鸡传染性喉气管炎病毒gD蛋白的重组嵌合型新城疫病毒La Sota株的构建

为构建表达鸡传染性喉气管炎病毒(ILTV)糖蛋白D(gD)的重组新城疫病毒(NDV)La Sota株,本研究将ILTV强毒株gD基因胞外域与NDV F基因信号肽、跨膜域和胞质尾区融合,并插入到含有NDV基因VII型F和HN基因的嵌合型La Sota株感染性cDNA克隆pLa Sota-VIIF/HN的P和M基因之间,将获得的重组感染性克隆pLa Sota-VIIF/HN-gD与辅助质粒pCIneo-NP-P-L共转染BHK-21细胞,拯救出表达gD蛋白的重组嵌合型NDV La Sota株rLaSota-VIIF/HN-gD,并采用血凝试验鉴定正确后,将重组病毒在9日龄SPF鸡胚中连续传至10代,提取10代重组病毒基因组RNA,反转录成c DNA作为模板,以ILTV gD基因插入位点两侧的鉴定引物进行PCR鉴定;采用第10代重组病毒感染BHK-21细胞,以ILTV gD蛋白多克隆抗体作为一抗进行间接免疫荧光试验(IFA);分别对鸡红细胞吸附的重组病毒感染的鸡胚尿囊液上清和从红细胞上解离下来的纯化的重组NDV病毒粒子经western blot鉴定,并对重组病毒对鸡胚的致病性和在鸡胚中的复制动态进行初步研究。PCR结果显示ILTV gD基因能够在重组病毒中稳定存在;IFA和western blot鉴定结果显示,重组病毒能够正确表达ILTV的gD蛋白,而且gD蛋白嵌合表达在重组病毒颗粒上。鸡胚致病性试验和鸡胚中的复制动态试验结果显示,重组病毒保持了La Sota疫苗株的低致病性和良好的复制特性,rLaSota-VIIF/HN-gD的鸡胚平均死亡时间(MDT)为168 h,1日龄雏鸡脑内接种该重组病毒的致病指数(ICPI)为0.20,鸡胚半数感染量(EID_(50))峰值可达10^(-8.66)/100μL。本研究所制备的重组病毒r LaSota-VIIF/HN-gD为研制基因VII型NDV和ILTV的二联活疫苗奠定了基础。

1株鸡毒支原体的分离鉴定及致病性研究

为了对1株从鸡场分离到的鸡毒支原体(MG)进行遗传进化分析及致病性研究。用MG的16S rRNA引物对山东省莱西市某鸡场疑似MG感染的气囊病料进行了PCR鉴定,结果可扩增到特异性条带。通过病原分离培养、16S rRNA基因测序比对获得MG分离株,命名为SDMg01株;低倍显微镜观察到,菌落呈典型的“荷包蛋”状;生化鉴定结果表明,该分离株能发酵葡萄糖,不水解精氨酸,不利用尿素。对分离株16S rRNA序列进行MEGA分析和构建系统进化树发现SDMg01分离株与其他MG菌株在同一进化分支上,其中与MG参考菌株(PG31)相似性为99.8%。对分离株SDMg01进行动物试验,感染8周龄的SPF鸡14 d后进行解剖,观察临床症状及气囊病理学变化;结果表明,SDMg01分离株致病性较强,可引起典型的气囊炎。本研究为MG诊断试剂的研制和疫苗候选毒株的筛选奠定了基础。

伪狂犬病病毒gE/gI缺失株CY-6的构建及免疫效力初步研究

构建针对伪狂犬病病毒gE和gI基因缺失的重组转移质粒pBL-gI-gE,将PRV-CY-ΔgI/gE-GFP病毒、pBL-gI-gE转移载体和Lipofectamin 2000转染试剂共转染BHK-21细胞,蚀斑筛选纯化法得到重组病毒PRV-CY-ΔgI/gE,命名为CY-6株。将CY-6株C1代在BHK-21细胞增殖并传至10代,测定生长曲线、病毒含量、基因鉴定、特异性、纯净、毒力和免疫原性。结果CY-6株的生长曲线与亲本CY株无明显变化,C1~C10代毒的病毒含量为10^(8.17)~10^(8.68) TCID50/mL,基因鉴定显示gE基因无366 bp的目的条带,gD基因有1条217 bp的目的条带,gI基因无331 bp的目的条带,特异性检验显示均能被伪狂犬病病毒特异性阳性血清中和;纯净检验该毒种无菌、支原体及外源病毒污染;毒力试验试验猪均5/5健活,免疫原性试验免疫组5/5保护,CY株攻毒对照组5/5发病,其中3/5死亡。以上结果表明伪狂犬病病毒CY-6株符合生产用毒种的初步要求,为研制新型伪狂犬病病毒基因缺失灭活疫苗奠定基础。

猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF4/ORF5基因区间的反向遗传操作:插入外源序列特性研究

猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)ORF4/ORF5基因间隔区有10个核苷酸(nucleotide,nt),为了探索ORF4/ORF5基因间隔区作为外源基因插入靶点的可行性,本研究通过突变PCR技术,获得一系列ORF4/ORF5间在不同位置插入不同碱基数及特定序列的突变体,随后进行了病毒拯救和复制分析。结果表明,在ORF4/5的10 nts间隔序列之前至少可插入13 nts;在间隔序列之后只能允许3 nts的插入;间隔序列之间能允许至少18 nts的插入,但允许插入的序列具有特异性,由此,暗示ORF4/5允许插入的外源序列与插入位置有关。本研究获得的诸多突变病毒为进一步研制PRRSV基因标识疫苗奠定了基础。

猪源牛病毒性腹泻病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立

本研究旨在建立一种荧光定量PCR检测方法,用于猪源牛病毒性腹泻病毒(BVDVs)检测,同时能鉴别诊断猪瘟病毒(CSFV)。根据BVDVs与CSFV 5′-UTR保守序列,设计一套引物和特异TaqMan探针,以本实验室构建的猪源BVDVs 5′-UTR阳性重组质粒为标准品,通过优化反应条件,建立了标准曲线。以构建的标准品为模板进行了特异性、敏感性、重复性试验、并应用于临床检测。结果显示,该方法检测CSFV、猪繁殖与呼吸综合征病毒均为阴性;最低可检测到每个反应相当于10拷贝的标准品DNA;重复性试验的批内变异系数为0.20%～0.95%;应用所建立方法对临床样品进行检测,其结果与普通RT-PCR结果的符合率为86.7%。本研究建立的实时荧光定量PCR具有特异、敏感、快速、重复性好等优点,可用于猪感染BVDVs、猪瘟疫苗污染BVDVs的监测。

鹅源番鸭呼肠孤病毒的分离鉴定

近几年,鹅“白点病”频发。本研究从江苏沛县地区肝脏有坏死点的发病鹅中收集肝脏病料,进行病毒分离,通过RT-PCR检测、序列分析进行病毒鉴定,并回归雏鹅进行致病性试验。结果发现:该毒株在鹅胚上生长良好;回归鹅能完全复制出临床中肝脏出现坏死点的病变,并能从实验鹅中重新分离到该病毒;对其主要抗原基因σC进行测序比对和进化树分析发现,其与番鸭呼肠孤病毒基因序列的进化关系较近,同源性为89.6~98.9%。本研究证实了鹅“白点病”的病原为番鸭呼肠孤病毒,为该病的防控奠定了基础。

猪圆环病毒2型基因工程亚单位疫苗的佐剂筛选

为筛选适合猪圆环病毒2型(porcine circovirus type 2,PCV2)基因工程亚单位疫苗的佐剂,将重组的PCV2 Cap蛋白抗原与佐剂混合,分别制备氢氧化铝胶佐剂、ISA 15A VG佐剂和IMS 251C VG佐剂疫苗,并选择PCV2阴性仔猪(14日龄)开展动物安全性检验和免疫效力检验。安全性检验结果显示:3组免疫高剂量(2倍免疫剂量)佐剂疫苗的仔猪在免疫后14 d内,精神、食欲、呼吸均正常,注射部位及其周围组织未见异常,仅IMS 251C VG佐剂组有2头仔猪出现发热症状(1~2 d)。免疫效力检验结果显示:3种佐剂疫苗免疫攻毒组仔猪免疫当天(接种前)PCV2抗体均为阴性,免疫第28天抗体均为阳性,其中ISA 15A VG佐剂组、IMS 251C VG佐剂组仔猪抗体S/P值均显著高于氢氧化铝胶佐剂组(P<0.05),均极显著高于空白对照组(P<0.01);于免疫第28天进行攻毒实验,攻毒对照组100%(5/5)发病,氢氧化铝胶佐剂组60%(3/5)保护,ISA 15A VG佐剂组和IMS 251C VG佐剂组均100%(5/5)保护。结果表明:ISA 15A VG是PCV2基因工程亚单位疫苗的适宜佐剂。

猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒M蛋白/N蛋白间与N蛋白/3'UTR引入重复序列的反向遗传操作

为获得一种经全长cDNA突变体拯救出的、随着传代次数的增多而最终致死的突变病毒,以嵌合感染性克隆p7AX12为骨架,分别在猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)M蛋白与N蛋白间或(和)N蛋白/3'UTR之间插入32 nt,依次构建4个嵌合突变体pBJ327、pBJ732、pBJD32和pBJD32R,经DNA转染Marc-145细胞后4个嵌合突变体均能拯救出病毒,且拯救病毒中的突变或插入的碱基具有遗传稳定性。突变病毒传代5次,没有最终致死的原因还有待于进一步研究分析。获得的4个突变病毒也为研制PRRSV基因标识疫苗及PRRSV复制转录机制研究奠定了基础。

禽4型腺病毒knob蛋白的原核表达及纯化蛋白的免疫原性研究

为研究Knob蛋白的免疫效果,将合成的mknob基因克隆至pET28a(+)表达载体,转化至大肠杆菌BL21感受态细胞,低温诱导表达,knob蛋白纯化后去内毒素,按不同剂量免疫SPF鸡。结果表明:重组质粒pET28a-mknob可以高效表达目的蛋白;Western blot结果表明,表达的蛋白可与禽腺病毒特异性血清发生特异性结合;免疫保护试验分析发现,10μg蛋白免疫SPF鸡即可产生100%保护。本研究为禽4型腺病毒亚单位疫苗的研发奠定了基础。

猪圆环病毒2d亚型病毒样颗粒的构建和鉴定

为了更有效的减轻猪圆环病毒2d亚型(PCV2d)感染对养猪业的影响,本试验利用昆虫细胞-杆状病毒表达系统制备PCV2d病毒样颗粒(VLPs),并进行鉴定。利用无缝克隆技术将PCV2d结构蛋白Cap的全长基因分别克隆至杆状病毒载体pFastBac Dual双启动子两端,构建重组质粒pFB-cap-cap。将pFB-cap-cap质粒转化大肠杆菌DH10Bac感受态细胞并经蓝白斑筛选后得到穿梭质粒rBacmid-cap-cap。将穿梭质粒转染昆虫卵巢细胞Sf 9,收获含cap基因的重组杆状病毒rBV-cap-cap,并通过间接免疫荧光试验(IFA)和Western blot鉴定Cap蛋白的表达,电镜观察是否形成VLPs。结果显示,重组质粒pFB-cap-cap经PCR鉴定构建成功,转染后收获的P1代重组杆状病毒rBV-cap-cap经PCR鉴定为阳性。IFA和Western blot鉴定结果显示,Cap蛋白成功在Sf 9细胞内表达,且能与PCV2单克隆抗体进行特异性反应。纯化后的Cap蛋白在电镜下观察能够组装成VLPs结构。结果表明,本试验在昆虫细胞-杆状病毒表达系统成功表达PCV2d Cap蛋白,并形成VLPs结构,为预防PCV2d提供参考。

传染性法氏囊病诊断技术研究进展

传染性法氏囊病是由传染性法氏囊病病毒引起鸡的一种高度接触性传染病,发病迅速,危害较大。本文对鸡传染性法氏囊病的流行病学、临床症状与病理变化、病原的分离诊断、免疫诊断和分子诊断等技术进行了综述。

新型鸭呼肠孤病毒病的研究进展

新型鸭呼肠孤病毒病是近年影响我国养鸭业的新发疫病,该病主要感染雏鸭,以肝脾出血和坏死为主要病理特征,因其能引起免疫抑制和生长障碍,给养鸭业造成严重经济损失。文章对新型鸭呼肠孤病毒病的流行病学、临床症状和病理变化、病原学、诊断方法、致病机制、预防与治疗措施等进行综述,阐述其研究进展,为深入研究和预防治疗该疫病提供参考。

应用免疫磁珠纯化猪圆环病毒2型病毒样颗粒的研究

为探讨应用免疫磁珠纯化猪圆环病毒2型病毒样颗粒的可行性,利用猪圆环病毒2型病毒样颗粒抗原特异性免疫磁珠,对经IPTG诱导表达的重组菌pET30a-Cap2d/Rosetta目的蛋白进行纯化,之后电镜观察纯化效果。结果显示,免疫磁珠可以特异性地结合猪圆环病毒2型病毒样颗粒。结果表明,应用免疫磁珠纯化猪圆环病毒2型病毒样颗粒是可行的。

不同佐剂制备鸡新城疫、禽流感二联灭活苗免疫效果评价试验

基于对市场现有佐剂产品的了解取不同佐剂产品作比较,以禽类疫苗为例。选取鸡新城疫、禽流感(H9亚型)二联灭活苗(Lasota株+WD株)灭活后抗原液,按不同佐剂的配苗比例分别配制灭活苗,验证其免疫效果。将添加不同佐剂配制的灭活苗分别免疫7日龄商品肉鸡,分6组,每组30只,其中1～5组分别免疫5种不同佐剂配制的禽流感灭活疫苗,6组为空白对照,各免疫0.3ml/只。分别于免疫后14、21、28、35d采血,离心后取血清,利用血凝抑制方法分别检测鸡新城疫和H9亚型禽流感血清抗体。计算抗体平均滴度。试验结果显示,MF59、GEL02和ISA70VG等新型佐剂较传统佐剂均能产生较高的抗体水平且能使机体在短期内快速产生免疫应答反应并能很好的维持其抗体水平。

重组猪α干扰素对猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)阳性血清中和猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)影响的研究

采用猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)/Marc-145细胞体系验证重组猪α干扰素(rPoIFN-α)增强PRRSV阳性血清对PRRSV的中和作用。结果表明,PRRSV阳性血清稀释至1∶0.588时,加上20 000 U/mL rPoIFN-α作用后,可以中和10~4TCID个猪繁殖与呼吸综合征病毒。研究结果在体外细胞水平明确rPoIFN-α增强了PRRSV阳性血清对PRRSV的中和作用,为进一步将rPoIFN-α应用于PRRSV的净化提供参考。

一种猪伪狂犬病毒野毒株快速检测方法的建立与应用

一种快速检测猪伪狂犬病毒gE基因的实时荧光定量PCR检测方法,根据gE基因序列设计一对引物与探针能区分PRV野毒株与疫苗株,并且不与猪细小病毒、猪繁殖与呼吸综合征、猪圆环2型病毒、猪瘟病毒、猪圆环1型病毒反应,具有很高的特异性,灵敏度可达到1×10拷贝/μL,具有很好的重复性,采用核酸免提缩短实验周期,给早期快速诊断及定量分析PRV野毒株感染提供有利条件。

猪源牛病毒性腹泻病毒套式PCR检测方法的建立

根据GenBank中BVDV-1、BVDV-2、CSFV及新出现瘟病毒的基因序列,设计2对特异引物,建立了能鉴别诊断BVDV与CSFV的Nested-PCR检测方法;确定其方法的特异性、敏感性、稳定性。建立的Nested-PCR能从BVDV标准毒株、猪源BVDV毒株中扩增198bp特异性片段,对猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒检测结果为阴性。结果表明,该方法具有较好特异性;其敏感性可检测到0.195fg RNA模板量;经重复性试验表明该方法具有良好稳定性。初步应用检测表明,猪BVDV阳性率较高,达36.0%;牛血清及其制品、猪瘟活疫苗BVDV污染严重。本试验建立的Nested-PCR具有敏感、特异和稳定等特点,可用于临床诊断和流行病学调查。

1株禽滑液囊支原体分离鉴定及生物学特性分析

自某鸡场脚垫肿胀的病鸡中分离出1株支原体菌,经形态学、培养特性、血清学特性、鸡红细胞吸附、生化特性以及基因鉴定等生物学特性分析确定其为禽滑液囊支原体,命名为MS01株,并测定其生长曲线。对该菌株进行鸡胚感染和毒力试验,结果显示接种鸡胚全部死亡,SPF鸡10/10发病,表明MS01株毒力较强;免疫原性试验中用该菌株制备的疫苗可100%抵御禽滑液囊支原体的攻击,具较好免疫原性。本研究为今后禽滑液囊支原体疾病的诊断和疫苗的开发奠定了基础。