大鼠角膜缘干细胞分离培养及其横向分化能力初探

目的体外分离培养大鼠角膜缘干细胞(LSCs),并探讨在细胞因子EGF、b FGF联合RA作用下,LSCs体外横向分化为神经干细胞样细胞的能力。方法体外分离培养LSCs并进行p63免疫组化鉴定。在原代培养的LSCs中,设立2个诱导组进行分化实验,诱导组1加入EGF(20 ng/mL)和b FGF(10 ng/mL),诱导组2加入EGF(20 ng/mL)、b FGF(10 ng/mL)和RA(25 ng/mL),同时设立空白对照组。培养7 d后,收集各组细胞作神经元标志物Nestin的免疫组化检测及阳性细胞计数,收集各组细胞蛋白做蛋白免疫印迹分析各组Nestin蛋白表达情况,相关数据作统计学分析。结果免疫组化结果显示,体外分离培养的LSCs p63呈阳性,诱导分化的2组细胞Nestin呈阳性表达,阳性率分别为(77.01±6.32)%和(84.01±5.43)%,诱导组2的诱导率高于诱导组1,差异具有统计学意义(P<0.05);对照组细胞Nestin呈阴性表达。蛋白免疫印迹结果显示,2个诱导组在240 k Da处可见Nestin蛋白条带,诱导组2 Nestin蛋白表达略高于诱导组1,对照组未见Nestin蛋白条带。结论成功分离培养大鼠LSCs,在细胞因子EGF、b FGF作用下,LSCs具有横向分化为神经干细胞样细胞的能力,同时联合使用RA有促进LSCs向神经干细胞样细胞分化的作用。

大鼠PAX6基因真核表达载体构建及鉴定

目的:构建携带绿色荧光蛋白(GFP)报告基因及PAX6基因的重组真核表达载体,观察其在人胚肾细胞(293FT)细胞中的表达。方法:采用聚合酶链式反应(PCR)从大鼠脑组织中获取PAX6基因,经连接T载体测序验证正确后,与真核表达载体p EF1α-IRES-Ac GFP经Sal I/Bam HI双酶切后;经T4 DNA连接酶连接,获得重组质粒p EF1α-PAX6-IRES-Ac GFP,用菌液PCR、Sal I/Bam HI双酶切及测序鉴定正确后,用脂质体法转染293FT细胞,采用倒置荧光显微镜观察GFP的表达、蛋白印迹(Western blot)法检测PAX6蛋白表达。结果:重组质粒p EF1α-PAX6-IRES-Ac GFP经RT-PCR和双酶切均得到大小为1 269 bp的目的条带,测序鉴定该序列与Gen Bank中大鼠PAX6基因序列的同源性达100%,插入基因的大小和方向正确;重组质粒转染293FT细胞后可见GFP绿色荧光,Western blot显示PAX6蛋白表达。结论:成功构建了PAX6真核表达重组质粒p EF1α-PAX6-IRES-Ac GFP,能在293FT细胞中表达PAX6蛋白。

β-神经生长因子基因克隆和诱导表达及其对PC12细胞的诱导分化作用

目的构建β-神经生长因子(β-NGF)慢病毒表达载体p LVX-TRE3G-IRES-β-NGF,应用Tet-on 3G四环素诱导表达系统,探讨β-NGF在人胚肾(HEK293FT)细胞中的过表达情况,及其对大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤(PC12)细胞分化的影响。方法从SD大鼠脑组织提取总RNA,反转录成c DNA,利用分子生物学技术,克隆鼠β-NGF基因完整编码区,将β-NGF基因定向插入载体p LVX-TRE3G-IRES中。将重组载体p LVX-TRE3G-IRES-β-NGF和载体p LVX-Tet3G分别转染空白HEK293FT细胞,制备收获慢病毒,共转染HEK293FT细胞,同时用不同剂量强力霉素(Dox)诱导NGF表达(分为未转染组、0、100、500和1000μg/L Dox诱导表达组)。48h后收集细胞,免疫印迹法(Western blotting)检测各组细胞内β-NGF表达情况。同时收集培养上清,1.ELISA检测各组上清内β-NGF的分泌量;2.制作条件培养基,加入PC12细胞培养基中进行诱导培养,观察PC12细胞诱导分化情况。结果双酶切和测序鉴定重组质粒p LVX-TRE3G-IRES-β-NGF序列和方向正确;β-NGF在转染细胞内被诱导表达,随着Dox剂量增加,表达量增强;β-NGF在培养基的上清内表达,表达量随Dox剂量增加而增多。诱导表达的条件培养基可诱导PC12细胞形态改变,表达神经元特异性烯醇化酶(NSE)蛋白。结论成功重组慢病毒载体p LVX-TRE3G-IRES-β-NGF,转染后β-NGF基因能够在HEK293FT细胞中表达和分泌,且该蛋白具有诱导PC12细胞向神经元样细胞分化的能力;运用Tet-On 3G四环素诱导表达系统,可成功诱导表达获得不同剂量β-NGF蛋白。

不同代昆明小鼠胚胎成纤维细胞的生长特性研究

目的分离培养昆明小鼠成纤维细胞,研究其体外生长特性并用于胚胎干细胞培养。方法消化法分离培养获得昆明小鼠胚胎成纤维细胞,利用MTT法绘制各代细胞生长曲线,免疫荧光对各代细胞进行细胞骨架分析;用不同浓度丝裂霉素C(10μg/mL、20μg/mL和30μg/mL)分别处理MEFs1、2、3h,MTT法筛选饲养层制备的最佳条件,制备饲养层用于小鼠胚胎干细胞的培养。结果分离的小鼠胚胎成纤维细胞3~5代细胞增殖能力较好;1~3代细胞微管微丝排列整齐,5代以后的细胞微管微丝排列紊乱;10μg/mL丝裂霉素C处理2h有利于小鼠胚胎干细胞的培养。结论体外分离培养的3~5代小鼠胚胎成纤维细胞可用于小鼠胚胎干细胞的培养。

德育渗透在高职护理专业解剖与组胚教学中的实践

目的对比高职护理专业解剖与组胚教学中常规教学模式、德育渗透模式的效果。方法按照教学方法的不同,将我校护理专业的52名学生分为对照组与观察组,对比两组学生的教学效果。结果观察组章节成绩、期末成绩,相对于对照组明显较高,差异具有统计学意义(P<0.05);观察组学生掌握系统知识、掌握重点内容、学习效率、学习主动性、学习兴趣等高于对照组,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论德育渗透用于高职护理专业解剖与组胚教学中能明显提高学生理论、实践知识,有极大的实践价值。

探讨腹腔感染对肠道Cajal细胞及肠道功能的影响

目的分析腹腔感染对肠道功能以及肠道Cajal细胞产生的影响,为预防腹腔感染和治疗提供一定实验基础。方法 40只小鼠,随机分为观察组(腹腔感染组)与对照组(假手术组),各20只。通过激光共聚焦显微镜观察小鼠肠道Cajal细胞的改变情况,并对小鼠手术后24 h肠段平滑肌收缩情况与小肠收缩功能进行观察。结果对照组小鼠肠道推进率为(81.54±4.58)%,观察组小鼠肠道推进率为(65.45±3.11)%;观察组小鼠肠道推进率明显低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。观察组肠道平滑肌收缩频率与收缩幅度明显低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。观察组小鼠全层铺平阳性细胞数减少率明显高于对照组,其肌间神经丛c-Kit阳性细胞阳性面积明显小于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论小鼠肠道Cajal细胞会受到腹腔感染的损害,从而导致肠道动力学功能出现变化,因此临床对于肠道疾病出现腹腔感染症状要重视其腹腔感染的预防与控制,促进肠道疾病患者的生存质量、生存率以及治愈率明显提高。

豚鼠胰腺内telocytes形态学特点及甲磺酸伊马替尼对telocytes的干预作用

目的对豚鼠胰腺组织特络细胞(telocytes,TCs)的形态特征进行观察与分析,并探讨甲磺酸伊马替尼对TCs的干预作用。方法以健康9周龄豚鼠胰腺为研究对象,利用免疫组化染色对TCs免疫标志(c-kit/CD117、vimentin)进行观察分析。透射电镜观察TCs的超微结构。建立甲磺酸伊马替尼干预模型:豚鼠54只,雌雄不限,分正常对照组、用药组(7、14、21、28 d)、停药组(W7、W14、W21、W28 d);免疫组化染色观察用/停药后TCs变化;Western blot观察用/停药后胰腺组织内CD117、vimentin蛋白表达。结果免疫组化染色显示:胰腺内TCs位于结缔组织内,细胞呈现三角形及长梭形等多种形态,有一至多条长而细的细胞突起,突起包绕腺泡,并相连形成网络结构;电镜超微结构显示:TCs有念珠状的细长突起,核质比较高,胞质内含有少量的线粒体、滑面内质网等;甲磺酸伊马替尼干预后,TCs突起变短,网络结构减少,停药后逐渐恢复;用药后胰腺组织内c-kit/CD117和vimentin蛋白表达降低,停药后逐渐恢复,差异有统计学意义(P<0.05)。结论豚鼠胰腺内存在梭形有念珠状突起的TCs,TCs包绕腺泡形成网络结构;甲磺酸伊马替尼可影响胰腺内TCs的形态及蛋白表达。

甲磺酸伊马替尼调控Telocytes对下颌下腺唾液分泌功能的影响

目的探讨甲磺酸伊马替尼调控Telocytes(TCs)对下颌下腺唾液分泌功能的影响。方法采用免疫荧光染色技术对TCs免疫标记物(C-kit/CD117、CD34)进行双标记染色,进而对小鼠下颌下腺内TCs进行定位。采用透射电子显微镜(TEM)显示小鼠下颌下腺内TCs的超微结构及其与周围细胞之间的关系。建立甲磺酸伊马替尼干预模型,实验小鼠分5组:正常组(共24只),用药1周、2周、3周、4周组(共24只),药物以80 mg/(kg·d)每日灌胃,免疫荧光显示,用药前后下颌下腺内TCs的变化;免疫印迹法(Western blotting)观察用药前后CD117、CD34及下颌下腺内α唾液淀粉酶(α-Amy)蛋白表达水平的变化。结果免疫荧光染色显示,TCs广泛分布于下颌下腺结缔组织内,胞体较小有突起(Tps),Tps相互连接成网络样结构,包绕着腺泡及导管,随甲磺酸伊马替尼干预时间延长,用药组Tps构成的网络样结构变稀疏。超微结构显示,Tps呈念珠状,与邻近组织紧密相连,周围可见胞外囊泡。随用药时间的增加Tps减少,TCs胞内囊泡增多,胞内细胞器减少。免疫印迹法显示,用药后CD117、CD34、α-Amy蛋白表达水平相应减少且互为正相关。结论小鼠下颌下腺内存在TCs,甲磺酸伊马替尼对TCs的干预可能会通过影响TCs的结构、免疫表型和细胞间通讯降低下颌下腺唾液分泌功能。

激光与熔融石英作用的温度累积研究

基于傅里叶热传导方程,利用有限差分法计算了石英在激光作用下的温度场分布。结果表明在连续激光的作用下,石英的轴向温度变化分为升温过程和降温过程。考虑热累积效应,辐照0.1、0.5、0.8s后温度较之前分别升高了约10、100、200℃,激光作用时间越长,温度累积越明显。对于脉宽为5ms,占空比为1/2和1/3的脉冲激光,辐照3个脉冲后,温度分别升高94℃和82℃。石英在轴向方向的温度累积较径向更明显。研究激光与石英相互作用后温度场的分布对激光加工工艺有着重要的意义。

不同产地狗肝菜中多糖的含量测定

目的:考察不同产地狗肝菜中多糖的含量。方法:采用蒽酮-硫酸比色法测定不同产地狗肝菜中多糖的含量。结果:在15-105μg范围内,葡萄糖μg数与吸光度A值线性关系良好,平均回收率为99.52%,RSD=2.12%,R2=0.9997。不同产地的狗肝菜中多糖含量为5.77%-31.49%。结论:各产地狗肝菜中多糖含量差异较大;野生品多糖含量高于栽培品;以广西桂林产狗肝菜中多糖含量为最高。