凝血酶原酶基因在小鼠严重急性呼吸综合征肺损伤中的作用

目的:利用鼠肝炎3型病毒(MHV-3)建立小鼠严重急性呼吸综合征(SARS)模型,探讨小鼠fgl2凝血酶原酶基因(mfgl2)与SARS肺损伤,尤其是透明膜和血栓形成之间的关系及其临床意义。方法:Balb/cJ小鼠气管途径感染MHV-3建立小鼠SARS模型,动态观察小鼠一般情况、组织器官的病理学改变及病毒分布情况;免疫组化和原位杂交方法检测其肺组织中mfgl2和纤维蛋白的表达。结果:感染小鼠5 d内死于以肺损伤为主的多器官功能衰竭;肺呈现典型间质性肺炎样改变伴透明膜、血栓形成;所有收集的器官均可检测到病毒的复制;肺支气管浆液腺上皮细胞、间质浸润细胞及肺泡上皮细胞可检测到mfgl2的特异性表达;免疫组化双染色发现肺内透明膜及微血栓形成区域多见mfgl2与纤维蛋白的共沉积。结论:MHV-3诱导的小鼠SARS模型能较好地模拟人类SARS肺损伤的疾病特征,mfgl2在模型肺组织中的特异性高表达可激活凝血酶原,启动局部凝血过程,导致纤维蛋白的沉积,促进肺内血栓和透明膜的形成,提示mfgl2可能是SARS肺损伤又一重要分子机制。

氢饱和生理盐水对内毒素诱导的大鼠葡萄膜炎的影响

目的探讨氢饱和生理盐水(hydrogen rich saline,HRS)对内毒素诱导的大鼠葡萄膜炎(endotoxin-induced uveitis,EIU)是否有减轻作用。方法健康成年雄性SD大鼠按随机数字表法分为正常组、模型组、氢饱和生理盐水(氢水)组和激素组,于后3组大鼠足垫部皮下注射0.125 mg/kg内毒素诱导葡萄膜炎。氢饱和生理盐水组大鼠于造模后0、0.5、1、2、6、8、12、24 h和3周内每天1次,腹腔注射氢饱和生理盐水20 m L/kg;激素组大鼠于造模后立即腹腔注射地塞米松磷酸钠注射液1 mg/kg。4组于造模后12、24、48、72、96 h在裂隙灯下观察葡萄膜炎表现,并进行量化评分;并于造模后1、4、7、10、14 d和21 d行视网膜电图检查、房水蛋白定量及病理组织学检查。结果氢饱和生理盐水组葡萄膜炎程度与模型组相似,裂隙灯临床表现量化评分和炎症细胞计数差异均无统计学意义(P>0.05);内毒素诱导的大鼠葡萄膜炎模型的视网膜功能有改变,暗适应3.0反应b潜伏期延长;与模型组相比,氢饱和生理盐水组b波潜伏期有缩短趋势,但差异无统计学意义(P>0.05);氢饱和生理盐水组房水蛋白总量较模型组略低,差异有统计学意义(P<0.05)。结论氢饱和生理盐水对内毒素诱导的大鼠葡萄膜炎无明显减轻作用。

慢性病毒性肝炎小鼠动物模型的建立及其特征分析

慢性病毒型肝炎是一种严重危害人类健康的常见病,多发病,目前尚缺乏理想的实验动物模型来阐明其具体的发病机制,从而使得对其防治的研究受到限制。本研究采用纯化的3型鼠肝炎病毒(MHV-3)经腹腔注入近交系C3H/HeJ小鼠体内,小鼠感染MHV-3后,约63%存活,存活的小鼠一般情况较正常对照组差,肝脏组织呈现持续炎性改变,血清ALT、AST升高而TP、ALB有所下降,与人类慢性病毒性肝炎的发生发展极为相似,可作为研究慢性病毒性肝炎的比较理想动物模型。

恶性肿瘤组织中人纤维介素的表达及作用

目的研究恶性肿瘤患者病理组织中人纤维介素(human fibrinogen-like protein 2,hfgl 2)的表达及与纤维蛋白沉积的关系。方法采用免疫组化方法检测了11例结肠癌、15例宫颈癌、10例乳腺癌、9例食管癌、12例肺癌、16例胃癌患者的病理组织切片中hfgl 2及纤维蛋白的表达,分析二者的组织学关系,用RT-PCR方法检测了部分肿瘤组织与肿瘤细胞系中的hfgl 2 mRNA。结果免疫组化显示hfgl 2在上述肿瘤中均有表达,主要分布于间质浸润细胞、肿瘤实质细胞、肿瘤血管内皮细胞及细胞外基质,且在邻近有明显的纤维蛋白沉积。通过RT-PCR,在体外培养的数种肿瘤细胞系中未检出hfgl 2 mRNA,但在肿瘤组织中检出hfgl 2 mRNA表达明显高于正常组织。结论恶性肿瘤时存在hfgl 2的高表达,并且可能与肿瘤高凝状态的形成及肿瘤的演进有关。

TLR4/MyD88在实验性自身免疫性肝炎小鼠中的表达和意义

目的研究Toll样受体4(Toll-like receptor4,TLR4)、髓样分化因子88(myeloid differentiation factor88,MyD88)在实验性自身免疫性肝炎(experimental autoimmune hepatitis,EAH)小鼠中的表达情况,探讨TLR4/MyD88在自身免疫性肝炎发病中的作用。方法以同种系小鼠肝组织制备的肝抗原S-100与弗氏完全佐剂等体积混合,腹腔注射免疫C57BL/6小鼠建立EAH模型,并设立正常对照组。在EAH组小鼠免疫后28d取肝组织,行石蜡包埋,病理HE染色及Masson胶原染色,免疫荧光检查血清中自身抗体,采用实时荧光定量PCR方法检测各组小鼠肝脾组织TLR4、MyD88mRNA相对表达水平,免疫组化检测肝组织中TLR4蛋白水平表达情况。结果与正常组小鼠相比,EAH小鼠肝脏中TLR4、MyD88mRNA明显升高,脾脏中TLR4、MyD88mRNA表达水平下降,肝脏中TLR4蛋白表达增加。结论 TLR4和MyD88在自身免疫性肝炎小鼠肝脏中表达水平升高,可以通过TLR4/MyD88依赖型信号途径发挥作用,并可能促进肝纤维化,在自身免疫性肝炎发生发展过程中发挥重要作用。

KCTD9多肽抗体的制备和应用

目的:利用人工合成多肽制备针对人源、鼠源KCTD9(hKCTD9、mKCTD9)的特异性多克隆抗体,以期用于与KCTD9表达异常密切相关疾病的研究和诊治。方法:根据hKCTD9、mKCTD9基因编码的氨基酸序列合成多肽(Pep),并用化学方法与匙孔血蓝蛋白(KLH)连接,纯品Pep-KLH免疫纯种新西兰雄性大白兔,所制备的抗血清用ELISA、Western blot实验鉴定,并采用免疫组化法应用于正常人和乙型肝炎患者肝组织中hKCTD9的检测。结果:ELISA检测表明,用Pep-KLH免疫的大白兔所制备的抗血清可与Pep发生特异性免疫反应;Western blot结果显示,抗血清可识别MHV-3感染BALB/cJ小鼠PBMC特异性条带,相对分子质量(Mr)为37 kD。对正常人和病毒性乙型肝炎患者肝组织免疫组织化学染色发现hKCTD9在正常人和重型乙型肝炎患者均有表达,但是在重型乙型肝炎患者高表达。结论:所制备的KCTD9的多肽抗体(多克隆抗体)可识别mKCTD9和hKCTD9分子,具有与抗原特异性结合,为深入研究这一新发现的分子提供了有力的科学手段。

不同临床类型小鼠肝炎模型T细胞亚群的初步研究

目的探讨3型鼠肝炎病毒(MHV-3)感染不同品系小鼠所致不同临床疾病类型小鼠肝炎模型后体内T细胞亚群的动态变化。方法取Balb/cJ和A/J小鼠各8只,腹腔注射100pfu3型鼠肝炎病毒(MHV-3),采用流式细胞仪检测感染后0、24、48、72h外周血、脾细胞悬液以及肝脏组织中T淋巴细胞亚群包括CD3+CD4+CD8-、CD3+CD4-CD8+及CD3+CD4-CD8-T(DNT)细胞的细胞数及各自在T淋巴细胞中所占比率。结果Balb/cJ小鼠于感染后24h外周血、脾脏以及肝脏T淋巴细胞中DNT细胞比率明显升高直至小鼠3d后全部死亡,CD3+CD4+CD8-和CD3+CD4-CD8+T淋巴细胞比率相应下降;A/J小鼠感染后24～96h外周血和脾脏T细胞各亚群变化不明显。结论两种不同品系小鼠感染MHV-3后的不同转归及DNT细胞比率的不同改变提示DNT细胞可能在病毒性肝炎发生、发展中起着一定的作用。

环境亮度及瞳孔直径对人眼神经对比敏感度的影响

目的:研究环境亮度及瞳孔直径对神经对比敏感度函数(NCSF)的影响,并与对比敏感度函数(CSF)相比较。方法:招募健康男性志愿者10名10眼作为受试者,以右眼为测试眼,利用视觉监视系统设置不同环境亮度并附加眩光,测量自然、3.0mm和5.0mm瞳孔时的CSF;利用视觉质量分析仪测量3.0mm和5.0mm瞳孔时的调制传递函数(MTF),根据CSF与MTF的比值求得NCSF。结果:NCSF和CSF随环境亮度降低曲线整体下移,波峰向低频区移动,CSF更偏向低频区。CSF变化受NCSF和MTF共同作用,瞳孔开大,MTF下降,在明视觉环境和中间视觉环境中,NCSF和CSF上升,主要上升区为中低频区;当亮度较高或存在眩光源时,NCSF和CSF在中低频区上升不明显,在高频区有下降的趋势;在暗视觉环境中,小范围的瞳孔波动对NCSF和CSF没有显著影响。结论:NCSF能够反映视觉神经系统的功能,与MTF共同决定CSF。CSF曲线形状与NCSF相近,波峰更偏向低频区。环境亮度降低会使NCSF下降,CSF随之下降;瞳孔开大会使NCSF在中低频区上升,CSF随之上升,而环境较亮或存在眩光源时,NCSF和CSF在高频区都有下降的趋势。

双黄连、鱼腥草注射液抗鼠肝炎病毒3型的体外实验研究

目的:探讨双黄连、鱼腥草在细胞水平对鼠肝炎病毒3型(murine hepatitis virus,MHV-3)是否具有抑制作用。方法:细胞培养、蚀斑试验测定病毒滴度;MTT法进行药物毒性试验;蚀斑抑制试验检测双黄连、鱼腥草的抗MHV-3活性。结果:双黄连半数中毒质量浓度(TC50)为6 100μg.m l-1,抗MHV-3病毒的半数抑制质量浓度(IC50)为304.9μg.m l-1;鱼腥草的分别为500、22.06μg.m l-1。治疗指数(TI)双黄连为20.07,鱼腥草为22.67。两种中药成分对MHV-3病毒的抑制作用均存在明显的量效反应关系(P<0.01)。结论:双黄连、鱼腥草在细胞水平有显著的抗MHV-3作用。

急性热应激对肉鸡肉品质及热休克蛋白108mRNA表达的影响

研究不同强度热应激对肉鸡感官性状、血液生化指标和热休克蛋白(Hsp)108mRNA表达的影响,将80只30日龄的AA肉鸡随机分为4组,每组20只,对照组环境温度为(25±1)℃,其他3组受试鸡的环境温度迅速上升至(33±1)℃、(37±1)℃、(41±1)℃,并分别持续4h的热应激处理。宰杀后测定鸡胸肉的pH值、滴水损失、肉色和剪切力,利用临床血液病理学和荧光定量PCR的方法,检测宰前不同强度热应激对肉鸡血液生化指标及肌肉、心脏和肝脏中hsp108mRNA表达水平的影响。结果显示,宰前热应激明显降低宰后肉鸡胸肉的pH30min、pH24h和a*值,明显提高宰后肉鸡滴水损失、L*值和剪切力;随热应激温度升高,血清中肌酸激酶(CK)、乳酸脱氢酶(LDH)和丙二醛(MDA)活性逐渐升高,碱性磷酸酶(AKP)活性逐渐降低;hsp108mRNA表达水平大部分呈现下降的趋势,除了心脏33℃组表达量明显增高,其他应激组表达量均有所降低。建立的荧光定量PCR体系特异性好,灵敏度高,符合检测热休克蛋白mRNA转录水平的要求,表明热休克蛋白可作为热应激的一个敏感指标。

TCRγδ^+CD^(3+)CD^(4-)CD^(8-)双阴性T细胞在3型鼠肝炎病毒诱导的小鼠慢性病毒性肝炎发病中的作用

目的本研究拟探讨在MHV-3诱导的慢性病毒性肝炎模型小鼠外周血和脾脏TCRγδ+DNT细胞在T淋巴细胞中比例变化以及其主要表面分子标记的变化。方法取60只C3H/Hej小鼠,腹腔注射10pfu MHV-3;应用流式细胞仪三色或四色荧光分析法分别检测小鼠外周血和脾脏TCRγδ+DNT细胞在T淋巴细胞中的比例及其CD25、CD28、CD30和CD44表达的变化。结果 MHV-3诱导的慢性病毒性肝炎小鼠各时间点外周血和脾脏TCRγδ+DNT在T淋巴细胞中的比例较对照组显著升高(P<0.05);在感染后10天达到最高峰:外周血和脾脏TCRγδ+DNT细胞占T淋巴细胞的比例分别为4.8±1.5%和4.5±1.3%;模型小鼠外周血和脾脏TCRγδ+DNT细胞的表型均为TCRγδ+CD3+CD4-CD8-CD25-CD28-CD30-CD44+。结论感染MHV-3后C3H/Hej小鼠体内TCRγδ+DNT细胞的数量增加,提示TCRγδ+DNT细胞参与了MHV-3诱导的小鼠慢性病毒性肝炎的发生和发展过程。

准分子激光角膜原位磨镶术后远期视觉质量的观察

目的:研究接受准分子激光角膜原位磨镶术(Laser in situ keratomileusis,LASIK)患者的视觉质量在术后数年内是否稳定,应用视觉质量分析系统(Optical Quality Analysis System,OQASⅡ)对LASIK术后远期视觉质量进行评价。方法:从第四军医大学学员中招募志愿者作为受试者,从中选择曾行LASIK手术者35例70眼作为观察组,未行LASIK手术者70例140眼作为对照组,应用OQASⅡ比较近期观察组(LASIK术后2~4a)和远期观察组(LASIK术后5~11a)的视觉质量,通过设立近期对照组(≤22岁)和远期对照组(≥23岁)探讨年龄、用眼习惯等混杂因素对视觉质量的影响,并分别与近期观察组和远期观察组相比较。观察指标为客观散射指数(OSI)、MTF截止空间频率(MTF cutoff)、斯特列尔比值(SR)、100%对比敏感度的OQAS分值(OV100%)、20%对比敏感度的OQAS分值(OV20%)和9%对比敏感度的OQAS分值(OV9%)。结果:在术后数年内,观察组的OSI显著高于对照组,而MTF cutoff、SR以及OV100%、OV20%和OV9%显著低于对照组(P<0.05);随术后时间延长,视觉质量基本保持稳定,OSI有一定降低的趋势,而MTF cutoff、SR、OV100%、OV20%、OV9%有一定升高的趋势,但均没有统计学差异(P>0.05)。结论:LASIK是矫正近视的常用手术方法,随术后时间延长,因手术一定程度降低的视觉质量有恢复的趋势,但在数年内不能完全恢复,基本保持稳定的状态。OQAS能够对LASIK术后的视觉质量进行定性和定量分析,有助于近视矫正术后视觉质量的分析和手术方案的改进。

自身免疫性肝炎患者外周血CD8^+T淋巴细胞PD-1表达及意义

目的研究自身免疫性肝炎患者外周血CD8+T淋巴细胞程序性死亡受体1(PD-1)表达的变化。方法选择自身免疫性肝炎患者22例和健康人20例,使用流式细胞仪检测所有被研究者外周血CD8+T淋巴细胞PD-1分子的表达状况,比较不同分期和不同性别疾病患者PD-1表达水平。结果自身免疫性肝炎患者外周血CD8+T淋巴细胞PD-1分子阳性百分比为2.5±0.5%,显著高于健康对照组(0.5±0.1%,P<0.001);自身免疫性肝炎发病期患者CD8+T淋巴细胞表达PD-1百分比为2.6±0.7%,与缓解期比无统计学差异(3.4±0.8%);16例女性AIH患者外周血CD8+T淋巴细胞PD-1阳性百分比为3.5±0.7%,亦略高于6例男性患者的1.3±0.3%,但无显著统计学差异(P=0.1021),可能与例数较少有关。结论自身免疫性肝炎患者CD8+T淋巴细胞PD-1表达率增加,PD-1可能在自身免疫性肝炎的发病中起了重要作用。

非溶细胞性抗病毒作用机制的研究进展

本文综述了非溶细胞性作用控制病毒感染的研究进展,并着重指出了细胞因子在这一过程中的地位。即直接激活抗病毒作用以及通过调节免疫反应上调病毒抗原决定簇在感染细胞表面的呈递和表达,从而间接控制病毒感染。

实验性自身免疫性肝炎小鼠模型Fas/FasL的表达及凋亡研究

目的:建立实验性自身免疫性肝炎小鼠模型(Experimental autoimmune hepatitis,EAH),观察Fas/FasLigand(Fas L)的表达及其介导的细胞凋亡在自身免疫肝组织损伤中的作用。方法:以同种系肝抗原与弗氏完全佐剂充分乳化后两次经腹腔注入到C57BL/6小鼠体内建立EAH,观察其血清ALT、AST水平和肝组织病理学改变;免疫荧光检查血清中自身抗体;采用实时荧光定量-聚合酶链反应(Realtime-PCR)和免疫组化方法检测小鼠肝脏组织中Fas与FasL基因转录与蛋白的表达,TUNEL(脱氧核糖核酸末端转移酶介导的缺口末端标记)法检测小鼠肝组织细胞凋亡情况。结果:建模后第28天的模型组小鼠肝脏组织中,主要表达于肝细胞及浸润淋巴细胞的Fas和FasL在mR-NA及蛋白水平均明显增强(P<0.05);光镜观察见正常小鼠肝脏组织无异常改变,而模型组小鼠可见散在或局灶性的炎性细胞浸润,并于炎性区域中心及周围出现TUNEL阳性的肝细胞和淋巴细胞,模型组小鼠肝组织内细胞凋亡指数(Apoptosis Index,AI)明显升高。结论:实验性自身免疫性肝炎小鼠肝组织炎症浸润与细胞凋亡共存,通过Fas/FasL介导的细胞凋亡与自身免疫性肝炎发生发展有关。

重型乙型肝炎患者外周血细胞促凝血活性及新型促凝血因子hfgl2的表达

目的:了解各种临床类型乙型肝炎患者外周血细胞的促凝血活性(PCA)及新型促凝血因子人纤维介素(human fibrinogen like protein 2,hfgl2)的表达情况,及其与疾病进展的关系。方法:病毒性乙型肝炎慢性重型25例,健康对照25例,分离外周血单个核细胞(PBMC);病毒性乙型肝炎慢性重度和重型患者标本33例,病毒性乙型肝炎慢性轻度、中度共25例,健康对照25例分离其外周血白细胞(WBC)。用一期冻融法测量其PCA。采用免疫组化的方法检测hfgl2的表达。结果:病毒性乙型肝炎慢性重型患者PBMC的PCA较健康对照高出20倍。WBC的PCA在以下各组(健康对照组、病毒性乙型肝炎慢性轻中度组、病毒性乙型肝炎慢性重度和重型组)呈逐步上升过程,但组间差异无显著性意义。PCA在病毒性乙型肝炎慢性重型组患者PBMC中的表达显著高于其在WBC的表达。PCA在健康对照组PBMC和WBC的表达无显著差异,hfgl2在病毒性乙型肝炎慢性重型患者PBMC中的表达水平显著高于其在健康对照组中的表达。结论:病毒性乙型肝炎慢性重型患者PBMC中的PCA和hfgl2表达均显著升高,且其表达与疾病严重程度相关,hfgl2表达的强度(阳性细胞数)与PCA的升高呈正比相关。

纤维介素蛋白2凝血酶原酶在人肝癌细胞增殖和凋亡中的作用

目的:探讨纤维介素蛋白2凝血酶原酶(fibrinogen-like protein 2/fibroleukin,fgl2)在人肝癌(hepatocel-lular carcinoma,HCC)细胞系HCCLM6细胞的表达及在肿瘤生长中的作用。方法:用RT-PCR方法检测HCCLM6细胞在静息和细胞因子作用下fgl2mRNA水平的表达;用RNA干扰技术建立fgl2敲除的HCCLM6细胞模型;以流式细胞技术检测fgl2敲除后的HCCLM6细胞体外培养细胞周期和增殖指数的改变以及对TNF-α(肿瘤坏死因子-α)诱导凋亡的抵抗能力改变。结果:IFN-γ(干扰素-γ)、IL-1β(白介素-1β)和TNF-α均可在mRNA水平上调HCCLM6细胞fgl2的表达,以TNF-α诱导作用最为显著;fgl2干扰后HCCLM6细胞增殖指数显著降低,细胞周期分析S期比例显著下降;fgl2干扰对HCCLM6细胞在全培养基和无血清培养基中培养的凋亡率无显著影响,但在合并大剂量TNF-α诱导下,fgl2干扰可显著提高HCCLM6细胞的凋亡率。结论:炎性细胞因子可诱导HCCLM6细胞表达fgl2,fgl2的表达可直接促进肿瘤细胞的生长,并增强对TNF-α诱导凋亡的耐受。

尾静脉高压注射质粒DNA后体内表达的规律

目的研究小鼠尾静脉高压注射质粒DNA后，目的基因在体内分布表达的规律，以及该方法的转基因效率。方法将LacZ质粒按小鼠体重比稀释到一定的PBS中，经尾静脉快速高压注射导入小鼠体内，通过X-gal染色的方法在不同时间点观察目的基因在肝脏和其他脏器中的分布规律。结果含有CMV启动子的LaeZ裸质粒经小鼠尾静脉高压注射途径导入体内，24h后即开始表达，第3天出现表达高峰，1周后表达消失，基因转染率达5％-6％；用脂质体包裹质粒DNA后，再进行尾静脉高压注射，质粒在肝脏的表达效率可达18％-20％。结论应用尾静脉高压注射脂质体／质粒DNA复合物途径，目的基因在小鼠肝脏获得高效表达，该方法可以广泛应用于基因治疗的实验研究。

鼠肝炎病毒3型N蛋白Ⅰ区激活mfg12凝血酶原酶基因

目的:研究鉴定激活mfgl2凝血酶原酶基因之冠状病毒3型或A59型鼠肝炎病毒(MHV-3,MHV-A59)核心(N)蛋白的功能区域. 方法:应用定点突变技术、与mfg12启动子共转染实验明确mfgl2凝血酶原酶基因之MHV-3或MHV-A59 N蛋白的功能区域.N蛋白内含I基因突变病毒株A1b 110和其野生株A1b 111体外感染Balb/cJ小鼠巨噬细胞、I基因表达载体与mfgl2启动子共转染实验阐明I蛋白在mfgl2基因激活中的作用. 结果:N蛋白包含由两个可变问隔区(A,B)隔开的三个结构区(Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ),MHV-A59N蛋白I区可增强mfgl2转录活性,当其基因序列突变为非嗜肝性MHV-JHM或MHV- 21区序列时,则丧失激活mfgl2启动子转录活性的功能.I 基因突变病毒株Alb 110和其野生株Alb 111体外感染Balb/cJ小鼠巨噬细胞后对mfgl2的激活无显著差异,共转染实验阐明I蛋白并非mfgl2基因激活中的必备因素,该组mfgl2启动子转录活性与对照组无显著差异,而N蛋白可激活mfgl2启动子,使其转录活性提高62倍. 结论:鼠肝炎病毒N蛋白I区为激活mfgl2凝血酶原酶基因的病毒蛋白功能区域.