小鼠TAp63γ及两种突变体的原核表达、纯化和DNA结合活性

采用PCR扩增法得到小鼠TAp63γ野生型及两种缺失突变体的cDNA,3种cDNA与表达载体pGEX-2TK重组构建成GST融合表达质粒并转化感受态E.coli BL21(DE3),经IPTG诱导了小鼠TAp63γ野生型及两种缺失突变体的可溶性表达。诱导表达的菌液经离心收集菌体、超声破碎及Triton X-100增溶后获得可溶性表达蛋白粗提液。利用Glutathione Sepharose 4 Fast Flow亲合层析纯化出电泳均一的3种GST融合蛋白。凝胶滞留分析证实仅野生型小鼠TAp63γ蛋白能特异结合p53靶序列,经序列比对及同源建模分析,表明小鼠TAp63γDBD结合区的完整性、关键氨基酸的保守性及三维结构的相似性可能是其DNA结合活性所必需的。

考察尿素含量对重组人粒细胞刺激因子质量的影响

目的考察尿素含量对重组人粒细胞刺激因子(rhG-CSF)质量的影响。方法将含量分别为98%,99.5%的尿素用于rhG-CSF的变复性工艺,并对制成的原液、半成品和成品,按照2005年版《中国药典》分别进行各项质量检测。结果用含量为98%和99.5%的尿素原材料所生产的3批产品的原液和成品,均符合2005年版《中国药典》rhG-CSF注射液的各项要求。结论尿素原材料中尿素含量只要达到≥98.0%的标准就可用于生产,不仅工艺稳定,而且还能降低成本。

卡介菌及其衍生制品鉴别实验用BCG DNA国家参考品的研制

目的建立BCG DNA定性用国家参考品,供BCG菌株、卡介菌多糖核酸注射液等卡介菌衍生制品鉴别实验用。方法以紫外分光法检测260nm和280nm的吸光度值,比较A260/280的比值,考量国家参考品BCG DNA的纯度指标;以多重PCR法检测BCG DNA特异性缺失区RD1区是否存在,验证所制备的BCG DNA可作为定性用国家参考品,组织3家实验室对该参考品进行验证;并在不同时间,观察其稳定性。结果所制备的BCG DNA A260/286=1.96>1.8;BCG DNA国家参考品经多重PCR扩增BCG缺失区RD1的产物为约200bp DNA片段,与卡介菌巴斯德株DNA结果相同,3家实验室的验证结果一致,该制品经37℃4周,4℃3个月、6个月、12个月放置后,PCR结果不变。结论该BCG DNA制品纯度高,稳定,可作为BCG DNA定性用国家参考品,在卡介苗相关制品的质量控制中,做为BCG菌株、卡介菌多糖核酸注射液等卡介菌衍生制品鉴别实验用的国家参考品。

重组人干扰素α2b包涵体纯化方法的研究

目的研究重组人干扰素α 2b包涵体的纯化方法。方法超声破碎菌体 ,干扰素α 2b包涵体经洗涤液洗涤后 ,SDS -PAGE检测其纯度 ,VSV -WISH细胞系统测定干扰素活性。结果差速离心很难完全将包涵体和细菌碎片分开。超声破碎 6次和 9次的干扰素α 2b包涵体纯度和活性相近 ,均明显高于 3次超声破碎处理的包涵体。用含2～ 4mol/L尿素、1%TritonX - 10 0的洗涤液对干扰素α 2b包涵体洗涤 ,能提高包涵体纯度。结论建议超声破碎 6次 ,用含 2～ 4mol/L尿素、1%TritonX - 10 0的洗涤液纯化干扰素α

密码替换后人促红素基因在大肠杆菌中的高效表达及工程菌的发酵

目的 研究人工合成的hEPO基因在大肠杆菌中高效表达及工程菌高密度发酵条件。方法 将hEPO基因中大部分大肠杆菌稀有密码子替换成使用频率较高的密码子 ,人工合成hEPO全基因 ,然后将其插入表达载体PBV2 2 0中 ,转化大肠杆菌DH5α ,挑选构建正确的PBV2 2 0 hEPO DH5α菌落 ,经升温诱导 ,SDS- PAGE和Westernblot鉴定表达产物 ;观察改变培养基、培养时间、pH及溶氧量等条件对表达产物的影响。结果 经酶切分析 ,DNA测序鉴定 ,人工合成的hEPO基因已正确构建到表达载体中。通过高密度发酵培养 ,最终菌体密度达A6 0 0 =30 (相当于菌体 35g L) ,hEPO表达量达 30 %左右。结论 人工合成的hEPO基因在大肠杆菌中得到高效表达 ,并确定了该工程菌高密度发酵的适宜条件。

用多重PCR方法鉴别不同卡介苗菌株

目的用多重PCR方法鉴别不同卡介苗菌株。方法根据卡介苗DNA的6个目的区域的特点设计引物,进行多重PCR扩增,然后电泳检测分析。结果多重PCR方法能够鉴别不同卡介苗亚株。结论应用多重PCR方法鉴别卡介苗菌株具有专一性好、重复性高、快速简便等优点。

新型人白细胞介素-2(125-Ser)表达载体的构建和大肠杆菌中的表达

目的 构建新型人白细胞介素 2 ( 12 5 Ser)的表达载体 ,并在大肠杆菌中进行表达。方法 用PCR技术对天然人IL 2基因进行突变 ,并与表达载体 pET 11b连接 ,转化入大肠杆菌BL2 1中 ,用IPTG诱导表达。结果 将编码天然人IL 2的 12 5 Cys的密码子 (TGT)变成了编码 12 5 Ser的密码子 (TCT) ,在大肠杆菌中表达量达 2 7%。结论 构建了表达新型人IL 2 ( 12 5 Ser)的表达载体 ,并在大肠杆菌中获得高效表达 。

p63基因突变及其与发育相关疾病关系的研究进展

p63基因是一个与组织发育和细胞凋亡分化相关的重要功能基因,是外胚层、面部和四肢发育的一个关键调节因子。p63基因突变可引起具有不同症状的综合征,本文主要对p63基因突变及其与发育相关疾病关系的研究进展作一综述。

水分扩散阻滞对西林瓶装疫苗冻干表观塌陷形成的影响

目的探讨水分扩散阻滞对西林瓶装疫苗冻干表观塌陷形成的影响。方法选取乙型脑炎减毒活疫苗(简称乙脑疫苗)及A群C群流行性脑膜炎疫苗(简称流脑A+C疫苗),在不同装量(0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL/瓶)及不同冻结方式(急速及缓慢冷冻结晶)条件下,采用LSC型冻干机进行冻干,观察表观塌陷情况。将乙脑疫苗按0.6 mL/瓶分装,采用LYO-20(CIP、SIP)型冻干机进行冻干,初级干燥恒温时间为13、14、15 h时,利用压力回升试验(pressure rise test,PRT)测试残余水分,并观察表观塌陷情况。结果急速冷冻结晶的冻干工艺中,两种疫苗装量>0.6 mL时,均出现表观塌陷,且塌陷高度随装量的增多而升高,但未塌陷高度趋于一致。缓慢冷冻结晶的冻干工艺中,流脑A+C疫苗在装量较多时,可见表观塌陷;各装量的乙脑疫苗均产生塌陷,且随着装量的增加,塌陷高度逐渐升高。乙脑疫苗于干燥13、14、15 h时,存在少量残余水分,将制品升温进入解吸附干燥阶段,未发生表观塌陷。结论水分扩散阻滞是导致西林瓶装疫苗发生表观塌陷的因素之一。

酶标法检测抗菌素残留量数据处理方法的探讨

目的探讨酶标法检测抗菌素残留量的数据处理方法。方法采用卡那霉素和庆大霉素快速检测试剂盒(间接竞争ELISA法)检测乙型脑炎减毒活疫苗2种抗菌素的残留量;采用半对数直线、半对数二次曲线和对数直线3种方法,以最小二乘法对实验数据进行拟合处理,分析、比较实验点残差分布、残差平方和、相关系数和实验误差等指标。结果半对数直线拟合较差,半对数二次曲线和对数直线方程拟合较好;半对数二次曲线法中实验点在标准曲线两侧的分布较均匀,各点的残差平方和远小于半对数直线法;半对数二次曲线法和对数直线法所得标准曲线的相关系数较高,检测庆大霉素标准品的实验误差均小于半对数直线法。结论半对数二次曲线法和对数直线法均优于试剂盒推荐的半对数直线法,而在极限值处理、计算简便等方面对数直线法更优。