E2F-1过表达对胃癌细胞凋亡及相关基因表达的影响

背景与目的:E2F-1(E2F transcription factor1)基因是细胞周期的重要转录因子,也参与了细胞凋亡的过程,但机制尚不明确。本研究通过观察E2F-1过表达对胃癌细胞MGC-803凋亡的影响及对下游基因的调控,初步探讨其参与凋亡的分子机理。方法:用流式细胞仪检测稳定转染E2F-1的胃癌MGC-803/E2F-1细胞(实验组)、转染空载体的MGC-803/EV(阴性对照组)及未转染的MGC-803细胞的凋亡情况。再分别抽取MGC-803/E2F-1和MGC-803细胞的总RNA,采用逆转录的方法,制成cDNA,并以两种荧光Cy5和Cy3标记后作为探针(荧光交换芯片),与含有21522条人类基因表达谱芯片进行杂交。采用LuxScan10K/A双通道激光扫描仪扫描芯片上两种荧光信号,应用LuxScan3.0图像分析软件对芯片图像进行处理和分析与凋亡相关的基因的表达,再用RT-PCR针对性的对筛选得到的基因进行验证。结果:MGC-803/E2F-1组细胞的凋亡率明显高于MGC-803/EV组和MGC-803组,3组凋亡率分别为(8.40±0.91)%、(4.53±0.61)%、(4.97±0.47)%;基因芯片扫描筛选出与凋亡相关的差异表达基因15条,其中上调基因4条,下调基因11条;RT-PCR验证多条相关基因其上、下调趋势同基因芯片结果一致。结论:E2F-1基因过表达促进了胃癌MGC-803细胞的凋亡,其影响机制可能与这15条差异表达基因有关系。

转录因子CDX2过表达对人胃癌SGC-7901细胞增殖和细胞周期的影响

目的:探索CDX2过表达对人胃癌SGC-7901细胞增殖、生长和细胞周期的影响及其分子机制。方法:采用携带CDX2基因的重组慢病毒颗粒(LV-CDX2-GFP)感染SGC-7901细胞,作为实验组(LV-CDX2-GFP组);以对照慢病毒颗粒(LV-GFP)感染SGC-7901细胞,作为阴性对照组(LV-GFP组);空白对照组常规培养,不做任何处理。分别采用CCK-8法检测细胞的增殖活力,流式细胞术检测各组细胞周期的分布,半定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blotting技术检测细胞中CDX2、Bax、Bcl-2、cyclin D1和survivin mRNA和蛋白的表达。结果:与LV-GFP组和空白对照组比较,LV-CDX2-GFP组细胞增殖活力明显降低(P<0.05),G0/G1期所占比例上升(P<0.05),Bcl-2、cyclin D1和survivin mRNA和蛋白的表达降低(P<0.05),Bax mRNA和蛋白的表达上调(P<0.05),而LV-GFP组与空白对照组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论:慢病毒介导的CDX2过表达抑制胃癌细胞增殖和生长,使细胞周期停滞在G0/G1期,其机制可能与CDX2过表达使胃癌细胞Bcl-2、cyclin D1、survivin表达下调和Bax表达上调有关。

慢病毒介导Cdx2基因过表达抑制人胃癌MGC-803细胞增殖的分子机制

目的:探讨Cdx2基因过表达对胃癌细胞周期凋亡相关基因Skp2、Survivin、Bcl-2和Bax表达的影响,及其抑制人胃癌MGC-803细胞增殖的分子机制。方法:利用携带Cdx2基因的重组慢病毒颗粒(LVCDX2-GFP)、空载体慢病毒颗粒(LV-GFP)感染人胃癌MGC-803细胞,分别作为实验组(LV-CDX2-GFP)、阴性对照组(LV-GFP),未转染处理的人胃癌MGC-803细胞作为空白对照组,以上三组细胞按照常规培养,应用RT-PCR和Westren blot技术检测细胞中Skp2、Bax、Bcl-2以及Survivin基因的mRNA和蛋白的表达。结果:与LV-GFP组和空白对照组比较,LV-Cdx2-GFP组人胃癌MGC-803细胞Skp2、Bcl-2和Survivin基因的mRNA和蛋白的表达降低(P<0.05),Bax基因的mRNA和蛋白的表达上调(P<0.05),而LV-GFP组和空白对照组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论:慢病毒介导Cdx2基因过表达抑制人胃癌MGC-803细胞增殖,其分子机制可能通过Cdx2调控Skp2、Survivin、Bcl-2和Bax基因表达,进而启动下游相关信号通路有关。

慢病毒介导E2F-1基因过表达抑制人胃癌MGC-803细胞增殖的分子机制

目的探索E2F-1基因过表达抑制人胃癌MGC-803细胞增殖的分子机制。方法用携带E2F-1基因的重组慢病毒颗粒(LV-E2F-1-GFP)感染人胃癌MGC-803细胞,作为实验组(LV-E2F-1-GFP组);以对照慢病毒颗粒(LVGFP)感染人胃癌MGC-803细胞,作为阴性对照组(LV-GFP组);空白对照组常规培养,不做任何处理。用RT-PCR和Western blot技术检测细胞中Skp2、Bax、Bcl-2和survivin基因的表达。结果与LV-GFP组和空白对照组比较,LV-E2F-1-GFP组人胃癌MGC-803细胞Skp2、Bcl-2和survivin基因的mRNA和蛋白的表达降低(P<0.05),Bax基因的mRNA和蛋白的表达上调(P<0.05)。结论慢病毒介导E2F-1基因过表达可能通过降低Skp2、survivin、Bcl-2基因表达和上调Bax基因表达来抑制人胃癌MGC-803细胞增殖。

E2F-1过表达对人胃癌SGC-7901细胞增殖的影响及其机制

目的探讨E2F-1过表达对胃癌SGC-7901细胞增殖、生长和细胞周期的影响及其分子机制。方法采用携带E2F-1基因的重组慢病毒颗粒(LV-E2F-1-GFP)感染人胃癌SGC-7901细胞(LV-E2F-1-GFP组);以对照慢病毒颗粒(LV-GFP)感染人胃癌SGC-7901细胞作为阴性对照(LV-GFP组);空白对照组常规培养胃癌SGC-7901细胞,不作任何处理。分别采用CCK-8法检测细胞的增殖活力,流式细胞仪检测各组细胞周期的分布,RT-PCR和Western blot技术检测细胞中Skp2、Bax、Bcl-2、CylinD1和Survivin基因mRNA和蛋白的表达。结果与LV-GFP组和空白对照组比较,LV-E2F-1-GFP组人胃癌SGC-7901细胞增殖活力明显降低(P<0.05),G0/G1期所占比例上升(P<0.05),Skp2、Bcl-2、CylinD1和Survivin基因的mRNA和蛋白的表达降低(P<0.05),Bax基因的mRNA和蛋白的表达上调(P<0.05),而LV-GFP组和空白对照组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论慢病毒介导E2F-1基因过表达抑制胃癌细胞增殖和生长,使细胞周期停滞在G0/G1期,其机制可能与E2F-1基因过表达使胃癌细胞Skp2、Survivin、Bcl-2、CylinD1基因表达下调和Bax基因表达上调有关。

E2F1基因过表达对人结肠癌耐奥沙利铂细胞株HCT116/L多药耐药性的影响

目的探讨E2F1基因过表达对人结肠癌耐奥沙利铂细胞株HCT116/L多药耐药性的影响及作用机制。方法HCT116/L细胞分为HCT116/L+E2F1组﹑HCT116/L+NC组和HCT116/L组,HCT116/L+E2F1组和HCT116/L+NC组分别转染E2F1过表达重组慢病毒载体(p CMA-E2F1-HA)及其阴性对照慢病毒载体(pCMA-HA)。Western blot检测E2F1蛋白的表达水平;MTT法检测各组对化疗药物(阿霉素、5-FU和顺铂)的敏感性;流式细胞仪检测各组细胞内阿霉素的泵出率和细胞凋亡情况;细胞划痕实验检测细胞迁移情况。Western blot进一步检测耐药相关基因MDR1蛋白的表达水平。结果 HCT116/L+E2F1组的E2F1蛋白表达水平明显高于HCT116/L+NC组和HCT116/L组(P<0.05);HCT116/L+E2F1组对阿霉素、5-FU和顺铂的IC50值分别为(1.61±0.21)μg/mL﹑(5.22±0.12)μg/mL﹑(3.52±0.15)μg/m L,高于HCT116/L+NC组的(0.61±0.11)μg/mL﹑(3.93±0.54)μg/mL﹑(2.31±0.45)μg/mL和HCT116/L组的(0.69±0.13)μg/mL﹑(4.19±0.51)μg/mL﹑(2.51±0.42)μg/mL(P<0.05);HCT116/L+E2F1组阿霉素的泵出率为(22.51±0.12)%,亦高于HCT116/L+NC组的(10.92±0.09)%和HCT116/L组的(8.45±0.11)%(P <0.05);HCT116/L+E2F1组细胞凋亡率为(6.42±0.52)%,低于HCT116/L+NC组的(12.81±0.69)%和HCT116/L组的(11.45±0.31)%(P<0.05),HCT116/L+E2F1组能增强细胞迁移能力(P<0.05),并阻滞细胞于S期。HCT116/L+E2F1组中MDR1蛋白表达量为0.41±0.08,高于HCT116/L+NC组的0.19±0.08和HCT116/L组的0.15±0.07(P<0.05)。结论 E2F1基因过表达可降低人结肠癌耐奥沙利铂细胞HCT116/L对化疗药物的敏感性,上调MDR1基因表达,使化疗药物在结肠癌细胞内的蓄积浓度降低,从而增强人结肠癌耐奥沙利铂细胞HCT116/L的多药耐药性。

EIF4A1在胃癌组织中表达及其抑制剂对人胃癌细胞株增殖、存活、侵袭、迁移能力影响观察

目的观察真核翻译起始因子4A1(EIF4A1)在胃癌组织中的表达变化;另观察EIF4A1抑制剂(Silvestrol)对人胃癌细胞株SGC-7901增殖、存活、侵袭、迁移能力影响,并分析其可能机制。方法淋巴结转移阳性、阴性胃癌组织及匹配癌旁正常组织各20例份,采用免疫组化法检测各组织EIF4A1。取对数生长期SGC-7901细胞并分为3组,药物组加含120μg/m L Silvestrol(在DMSO溶剂溶解)的细胞培养液100μL,模型组加含0. 5%DMSO的细胞培养液100μL,对照组加细胞培养液100μL; CCK-8法检测细胞增殖活性,CountessⅡFL细胞计数仪计数活细胞数,Transwell实验检测细胞侵袭能力,划痕实验检测细胞迁移能力,qRT-PCR法和Western blotting法分别检测EIF4A1和AKT mRNA、蛋白。结果与癌旁正常组织比较,淋巴结转移阳性胃癌组织中EIF4A1高表达例数多(P<0. 05)。各组OD值及活细胞数两两比较,P均> 0. 05;与模型组、对照组比较,药物组侵袭细胞数少,细胞迁移距离长,EIF4A1和AKT蛋白、mRNA表达降低(P均<0. 05)。结论淋巴结转移阳性胃癌组织中EIF4A1表达量高于癌旁正常组织; Silvestrol不影响SGC-7901细胞的增殖、存活能力,但可抑制细胞侵袭、迁移能力,其机制可能与Silvestrol调控AKT信号通路有关。

基于生物信息学分析结直肠癌STIM1高频突变介导的免疫抵抗模式及其分子机制

目的探讨结直肠癌(colorectal cancer,CRC)基因突变频谱及其介导的CRC免疫抵抗的分子机制。方法选择2019年1月至2020年1月广西医科大学附属肿瘤医院收治的CRC患者36例,采用新一代测序(NGS)技术检测组织和血液样本中的基因突变情况。对突变频谱进行分子网络事件描述,采用TIMER和CancerSEA数据库对核心分子进行免疫浸润和组织单细胞分布分析,用Reactome数据库对核心分子进行功能聚类分析,利用STRING数据库分析核心免疫抵抗事件网络。结果组织和血液样本检测结果显示,基质相互作用分子1(stromal interaction molecule 1,STIM1)为筛选的高频突变基因(突变频率为97.2%)。免疫浸润和单细胞分布显示STIM1与RELA、JUN共同参与免疫反应,STIM1、RELA与JUN mRNA在结肠癌患者中的表达与CD4^+T细胞的浸润水平显著相关(r=0.554,0.565,0.319,均P<0.05),且RELA、JUN均与STIM1呈正相关(r=0.579,0.223,均P<0.05)。Kaplan-Meier分析结果显示,CD4^+T细胞和巨噬细胞浸润水平越高,结肠癌患者生存预后越差。功能聚类分析显示,STIM1与适应性免疫系统、固有免疫系统、免疫系统中的细胞因子信号转导以及免疫反应蛋白类泛素化修饰相关,PPI网络分析显示,STIM1与RELA、JUN相关。结论STIM1可能与RELA、JUN共同参与免疫抵抗网络形成,是CRC免疫抵抗中的重要调控因素及潜在的治疗靶点。

结直肠癌发生过程中普拉梭菌丰度变化的研究

目的:探究基于GMrepo数据库背景下,健康对照、腺瘤患者、腺癌患者肠道菌群多样性改变规律,为肠道菌群与结直肠癌的发生机制研究提实验室证据。方法:GMrepo分析健康对照、腺瘤患者、腺癌患者肠道菌群丰度改变,并筛选出腺瘤癌变过程中丰度变化较大的菌群。收集35例结直肠腺瘤患者粪便,提取DNA进行宏基因组测序,建立文库。用MetaPhlAn与HUMAnN生信分析软件对菌群丰度进行分析与功能注释。数据处理与统计分析采用宏基因组学分析软件LEfSe7、STAMP8、QIIME9和R数据包。结果:GMrepo分析健康对照、肠道腺瘤患者、结直肠癌患者98个菌属中有3个菌属存在显著丰度差异,其中包括瘤胃球菌科、双歧杆菌科、梭菌科,其中瘤胃球菌科包括瘤胃球菌科和粪杆菌属。腺瘤到结直肠癌过程中普拉梭菌和双歧杆菌的丰度降低,而牙周梭杆菌的丰度增加。35例腺瘤患者宏基因组学测序结果显示,与健康对照比较,腺瘤患者的菌群丰度发生了显著变化,菌门水平上,放线菌门有显著差异;菌种水平上,普拉梭菌、罗氏弧菌、双歧杆菌、唾液链球菌有明显差异(P<0.05)。结论:普拉梭菌丰度降低,是发生在健康对照—腺瘤患者—腺癌患者全程中的事件,其丰度降低可能与结直肠癌发生相关,并且可能成为结直肠癌发生的一个微生物观察点。

尾型同源盒基因2过表达对人胃癌耐顺铂细胞SGC7901／DDP多药耐药性的影响

目的探讨尾型同源盒基因2（Cdx2）过表达对人胃癌耐顺铂细胞SGC7901／DDP的多药耐药性的影响。方法将SGC7901／DDP细胞分为实验组[Cdx2过表达重组慢病毒载体（pCMA-Cdx2-HA）处理]、空载体组[慢病毒载体（pCMA-HA）处理]、对照组（不做处理）3组。MTT法检测各组SGC7901／DDP细胞对化疗药物的敏感性；流式细胞仪检测各组SGC7901／DDP细胞阿霉素的泵出蓄积量、细胞周期分布及凋亡情况；Westernblot技术进一步检测Cdx2蛋白和多药耐药基因1（MDRl）的蛋白表达水平。组间比较采用方差分析。结果SGC7901／DDP细胞感染慢病毒载体72h后，转染效率达90％以上。实验组Cdx2蛋白的相对表达量为0．374-0．06，较空载体组的0．12±0．02和对照组的0．11±0．03明显升高，3组比较，差异有统计学意义（F=82．37，P〈0．05）。实验组SGC7901／DDP细胞对阿霉素、5．氟尿嘧啶和顺铂的半数凋亡浓度分别为（1．10±0．08）mg／L、（4．81±0．12）mg／L、（3．81±0．15）mg／L，均高于空载体组的（0．59±0．05）mg／L、（3．71±0．14）mg／L、（2．20±0．15）mg／L和对照组的（0．63±0．04）mg／L、（3．92±0．15）mg／L、（2．92-4-0．11）mg／L，3组比较，差异有统计学意义（F=158．75，98．06，188．78，P〈0．05）。实验组阿霉素的泵出率为18．20％±0．12％，高于空载体组的7．22％±0．09％和对照组的8．79％4-0．11％，3组比较，差异有统计学意义（F=146．31，P〈0．05）。实验组G．期细胞的比例为52．2％±4．4％，明显低于空载体组的62．0％±5．O％和对照组的67．8％±3．3％；实验组S期的细胞比例为40．4％±1．5％，明显高于空载体组的25．6％±2．O％和对照组的21．8％±1．3％，3组细胞G．期和S期比较，差异均有统计学意义（F=17．08，236．83，P〈0．05）。实验组细胞凋亡率为7．6％±1．3％，明显低于空载体组的11．1％±1．1％和对照组的10．8％±1．0％，3组比较，差异有统计学意义（F=16．29，P〈0．05）。实验组中MDRl蛋白的表达量为1．854-0．18，高于空载体组的1．124-0．08和对照组的1．024-0．09，3组比较，差异有统计学意义（F=76．22，P〈0．05）。结论Cdx2基因的过表达可降低胃癌耐顺铂细胞SGC7901／DDP对化疗药物的敏感性，降低化疗药物在胃癌细胞内的蓄积浓度，增强胃癌多药耐药细胞的耐药性。

过表达细胞周期相关转录因子1的MGC-803细胞抗原致敏树突状细胞对胃癌细胞的杀伤作用

目的观察过表达细胞周期相关转录因子1（E2F-1）的MGC-803稳定株所制成的细胞抗原所引起的树突状细胞（Dc）介导的细胞毒性T淋巴细胞（CTL）体外杀伤胃癌MGC-803细胞的作用。方法用30阻g／L重组人白细胞介素4（rhlL-4）、100μg／L重组人粒细胞巨噬细胞刺激因子（rhGM—CSF）、50μg／L重组人肿瘤坏死因子-γ（rhTNF—α）和100μg/L脂多糖（LPS）联合诱导健康人外周血单个核细胞成为DC，通过形态学及流式细胞仪对DC进行鉴定；实验分E2F-1组、NC组、MGC．803组和DC组，采用细胞计数试剂盒（CCK一8）法分别在DC：T为1：5、1：10、1：20、1：40时检测T淋巴细胞的增殖；采用乳酸脱氢酶（LDH）释放法在T淋巴细胞：MGC一803细胞分别为10：1、20：1、50：1时检测杀伤效果；用酶联免疫吸附试验（ELISA）法检测培养液中的干扰素（IFN）一叮的含量变化。结果形态学和流式细胞仪检测结果显示经诱导的DC细胞成熟特征明显，过表达E2F-1组T淋巴细胞增殖能力刺激指数（SI）值（4．42±0．23）高于空载体组（2，95±0．53）和空白对照组（3．014-0．68），差异有统计学意义（P〈0．05）；过表达E2F，1抗原致敏的DC诱导的CTL对胃癌MGC-803细胞株的杀伤率[（65．00±8．24）％]高于DC—CTL组[（45．25±7．89）％]、单纯MGC-803组[（41．83±4．79）％]、空载体组[（31．16±11．96）％]和空白对照组[（33．25±8．38）％]，差异有统计学意义（P〈0．05）；过表达E2F-1抗原组T淋巴细胞分泌IFN-1的量[（571．03±5．96）ng／L]高于空载体组[（382．85±4．94）ng／L]、MGC-803组[（390．13±7．06）ng／L]和DC组[（356．03±5．36）ng／L]，差异有统计学意义（P〈0．05）。结论过表达E2F-1的MGC-803抗原致敏的DC在体外可增加T淋巴细胞的增殖，加强T淋巴细胞对MGC-803细胞的杀伤力。

慢病毒介导特异性核转录因子尾型同源基因2过表达对人胃癌裸鼠耐药模型耐药性的影响及其机制

肿瘤细胞多药耐药性与某些基因密切相关，Takakura等研究结果显示，特异性核转录因子尾型同源基因2（CDX2）与肿瘤多药耐药性密切相关，但作用机制尚不明确。本实验旨在观察CDX2基因过表达后对人胃癌耐顺铂细胞SGC-7901／DDP裸鼠皮下移植瘤耐药性产生的影响，并进一步检测经典多药耐药相关基因多药耐药基因1（MDR1）、