21羟化酶缺乏症高风险胎儿的产前诊断分析

目的对1例21羟化酶缺乏症(21OHD)先证者家系CYP21A2基因缺陷高风险胎儿进行产前分子诊断。方法提取先证者及其父母的外周血DNA,分段扩增CYP21A2基因全长并测序,确定先证者及父母基因型。采用亲子鉴定试验排除母体DNA污染。针对先证者突变位点,扩增羊水DNA并测序。结果测序结果显示先证者存在IVS2-13A>G纯合突变,父母均为携带者。比较STR位点未见羊水DNA受母体DNA污染迹象。胎儿为该突变杂合子,判断胎儿为携带者。培养后羊水检测结果与培养前一致。胎儿娩出后发育良好,证实了产前诊断结果。结论建立了21OHD产前分子诊断方法,并成功应用于1例21OHD高风险胎儿的产前诊断分析。

不明原因男性不育人群中睾丸特异性乳酸脱氢酶基因突变的发现及其意义

为了研究睾丸特异性乳酸脱氢酶,即乳酸脱氢酶C4(LDH-C4)基因突变在男性不育发病中的作用,利用LDH-C4特异性底物对100名不明原因男性不育症患者的精子LDH-C4进行活性显色,用变性高效液相色谱(DHPLC)技术对LDH-C4活性低下的患者进行LDHC基因PCR产物的突变筛查,对DHPLC峰形异常的PCR产物进行序列测定.筛选到一组精子LDH-C4活性明显下降的患者,其中1名患者的LDHC基因PCR产物在DHPLC中呈异常洗脱峰.对这一PCR产物进行序列测定,发现患者LDHC基因第5外显子的115位碱基发生了T→A的杂合改变(GenBank登录号GU479375),该突变使LDHC基因的178位密码子由原来的TTG(编码亮氨酸)变为TAG(终止密码子),形成截短的C亚基.T克隆-测序进一步证实了该无义突变的杂合状态.这是在人类LDHC基因上发现的第一个突变,提示LDHC基因突变可能是男性不育发病的原因之一.

精子生成障碍患者Y染色体AZFc区部分缺失分析

目的:探讨人类Y染色体无精子症因子C区(AZFc)部分缺失对男性精子生成的影响。方法:选择Y染色体AZFc区9个序列标签位点(STS)sY1258、sY1291、sY254、sY255、sY1201、sY1206、sY1161、sY1197、sY1191,以ZFX/ZFY(X/Y连锁锌指蛋白基因)和SRY(sY14)基因为内对照。对160例Y染色体微缺失筛查均未发现缺失的无精子症及严重少精子症患者,76例正常生育男性DNA进行多重PCR扩增。疑有DAZ基因缺失的个体,采用基因单核苷酸变异分析(single nucleotide variants,SNV)技术,对DAZ基因4个拷贝中的单核苷酸多态位点进行检测,以确定DAZ基因的拷贝缺失类型。结果:160例无精子症及严重少精子症患者(病例组)gr/gr(sY1291)缺失10例,占6.3%;b2/b3(sY1191)缺失14例,占8.8%;新发现sY1291,sY1197缺失1例,占0.6%;b1/b2缺失1例,占0.6%;b1/b3缺失1例,占0.6%。76例正常生育男性(对照组)检出gr/gr缺失4例,占5.3%;b2/b3缺失4例,占5.3%。gr/gr缺失和b1/b3缺失(对照组和病例组)SNV分析均为DAZ1/DAZ2缺失;b2/b3缺失(对照组和病例组)SNV分析均为DAZ3/DAZ4缺失。1例sY1291,sY1197缺失的DAZ-SNVsY587位点缺失,1例b1/b2缺失者DAZ基因未缺失。结论:b2/b3(sY1191)缺失、gr/gr(sY1291)缺失在我国正常人群中多见,为基因组多态性;b1/b2缺失、b1/b3缺失和sY1291,sY1197缺失可能是导致精子生成障碍的高风险因子。

DHPLC在X-连锁肾上腺脑白质营养不良分子诊断中的应用(附12例报告)

目的探讨DHPLC在X-连锁肾上腺脑白质营养不良(X-ALD)分子诊断中的应用。方法提取12个X-ALD家系及成员的外周血基因组DNA,分15个片段扩增ABCD1基因的10个外显子,应用DHPLC技术对其进行突变筛查,并对出现异常洗脱峰的PCR产物进行DNA序列测定,证实突变位点的存在。结果12个X-ALD家系存在12种不同的ABCD1基因突变,包括8个错义突变、2个移码突变和2个无义突变,即P534R、G343V、R259W、A141T、R401Q、K276E、Y174C、A314P、fs E471、fs A247、S108X和Q177X。结论DHPLC筛查结合DNA序列测定能快速有效检测出ABCD1基因突变。不同的X-ALD家系有不同的ABCD1基因突变位点,突变类型和表型之间无特殊相关关系。

外显子组测序在抗肌萎缩蛋白基因检测到一个新的剪接供体位点突变

目的应用外显子组捕获和第2代测序技术检测抗肌萎缩蛋白基因(dystrophin)中的微小突变。方法通过外显子组捕获和第2代测序技术对1例具有典型杜氏肌营养不良症(DMD)临床表现但没有外显子缺失或重复的患者进行dtstriogub基因突变检测,并用Sanger测序证实检测结果。以生物信息学预测基因突变所致该基因编码情况的改变。以患者母亲和100名体检正常者作为对照。结果在患者dystrophin基因内含子50的第1个碱基检测到1个碱基改变:G>C,其母亲在相同的位置发生了杂合改变。生物信息学预测此改变将使内含子50原有的5'剪接位点消失,导致其相应肽链C端氨基酸序列改变、终止密码提前出现。Sanger测序进一步证实了该突变的存在,且在正常对照未检测到该突变。这是在dystrophin基因上新发现的致病性剪接供体位点突变。结论外显子组测序技术可有效检测dystrophin基因微小突变,其应用可进一步完善DMD分子诊断体系。

产前亲子鉴定方法研究(附23例报告)

目的对23个产前案例进行亲子鉴定。方法超声监视下行羊膜穿刺术,抽取羊水30~40ml。离心收集羊水沉渣后提取其基因组DNA,同时抽取其父母双方外周血基因组DNA。应用毛细管电泳技术和五色荧光复合扩增的方法,检测所有DNA样本的16个STR基因座基因型。结果所有羊水基因组DNA均来自独立个体,无母体DNA的污染。三联体分析显示23个案例中17例为肯定亲权关系,亲子关系概率均大于0.9999,6例确定为排除亲权关系,平均排除（位点数）指标为7.67个。二联体分析显示23个案例中17例肯定父权的平均亲子关系概率为0.9997以上,6例排除亲权关系的平均排除（位点数）指标为5个,但其中1例的排除位点只有1个。结论16个STR位点的多重荧光扩增方法在对羊水中母体DNA的污染程度进行评估的同时,可以准确、可靠的应用于产前亲子鉴定。在检测单亲鉴定案例时,若排除（位点数）指标小于2时必须补充母亲样本或增加检测的STR位点指标数,直至得出明确结论。

脆性X综合征致病基因FMR1一个新型隐匿外显子发现及其鉴定

目的分析脆性X智力障碍1基因(FMR1基因)可变剪接表达类型。方法采用克隆-测序技术,从RNA途径分析人FMR1基因的可变剪接表达。结果构建健康人外周血cDNA53个T克隆,测序结果显示4个T克隆均有140bp大小的插入片段(NG_007529:21452-21591),为FMR1内含子9的一部分,生物信息学比对显示该片段上下游具有4个经典的剪接信号,可能为新的隐匿外显子。巢式PCR显示健康人多种组织cDNA中普遍存在该片段。杂种小基因剪接试验显示该片段可通过可变剪接,与上游的外显子9和下游的外显子10同时出现在体外培养真核细胞的成熟mRNA中。结论该研究发现人FMR1基因的新型隐匿外显子,丰富了人FMR1基因可变剪接的内容,也为进一步研究可变剪接与脆性X综合征发病机制之间的关系和脆性X智力障碍1蛋白的功能奠定了基础。

人外周血淋巴细胞FMRP的免疫细胞化学分析方法的建立

目的建立免疫细胞化学方法检测脆性X智力障碍蛋白(FMRP),进而实现脆性X综合征(FXS)的初步筛查。方法对20份正常样本及疑似FXS患者的标本进行免疫细胞化学染色和免疫荧光染色并计数阳性率。结果带绿色荧光的FMRP在淋巴细胞胞浆中表达与免疫组化相一致,正常标本正常阳性表达率范围为82%～96%,该疑似FXS患者的阳性细胞表达率为90%。结论可采用外周血淋巴细胞FMRP免疫细胞化学方法进行FXS的初步筛查。

甲基化特异性熔点曲线分析检测FMR1基因CpG岛甲基化状态方法的建立

目的建立一种可靠的检测脆性X智力障碍1基因(FMR1)CpG岛甲基化状态的方法。方法用亚硫酸氢钠对基因组DNA进行脱氨基修饰,以修饰后的DNA为模板,利用荧光定量PCR仪扩增FMR1基因CpG岛序列并进行熔点曲线分析,并对PCR产物进行克隆测序,验证其甲基化状态。结果分析包含10个CpG位点FMR1基因CpG岛105bp片段显示,非甲基化与甲基化引物扩增产物之间熔点温度相差2.5℃;克隆测序显示两者之间未被修饰的胞嘧啶相差7个。结论所建立甲基化特异性熔点曲线分析方法可以有效地检测FMR1基因CpG岛甲基化状态,为临床诊断脆性X综合征提供依据。

亲子鉴定实验用于评估产前诊断中母体细胞污染的研究

目的探讨亲子鉴定实验在产前诊断母体细胞污染(MCC)评估中的临床应用价值。方法选取2005-2019年来该院行产前诊断的134个单基因遗传病高风险家系的137例孕妇。于超声监视下行羊膜穿刺术,抽取羊水,提取羊水细胞基因组DNA。对羊水细胞基因组DNA、胎儿父母亲基因组DNA作亲子鉴定实验。采用多重荧光PCR技术扩增基因组DNA的15个短串联重复序列(STR)位点。根据分型结果判断是否存在MCC,以及MCC的程度。结果亲子鉴定实验结果显示,男性胎儿76例,女性胎儿61例,均未发现MCC;其中证实先证者为新发突变4例,占高风险家系的3.0%。所检测的胎儿特定遗传病基因型异常的有35例,占25.6%(35/137);回访121例,出生(引产)后的检查结果与产前诊断结果完全一致。结论基于多重荧光PCR技术的亲子鉴定实验可提示母体细胞对羊水细胞基因组DNA污染程度,确定胎儿的独立个体身份和性别,对提高产前诊断的准确性有重要意义。

外周血单个淋巴细胞遗传分析及其在遗传性疾病诊断中的应用

目的建立以外周血单个淋巴细胞遗传分析为基础的遗传病诊断方法,为基于单细胞遗传分析实现遗传病诊断的研究奠定基础。方法健康者、遗传病基因携带者外周血经淋巴细胞分离液,连续稀释处理后在体视镜下采用自制装置分离单细胞,对分离细胞行全基因组扩增(WGA)并利用目的基因一代测序评估其对于遗传病的诊断价值。结果该研究实现了β-珠蛋白生成障碍性贫血、法布里病、先天性肾病综合征的准确诊断。结论本研究的单细胞分离技术可快速地分离出单个淋巴细胞,与单细胞WGA联合能够实现遗传性疾病的准确诊断,为开展单细胞水平的遗传研究提供了思路。

产前诊断中羊水个体Amelogenin基因座X片段缺失一例

目前,由常染色体STR位点和Amelogenin基因组成的商品化试剂盒已被广泛应用于个体识别、亲权鉴定和DNA数据库的建立。而将其应用于产前遗传病诊断的报道则较少,本实验室是国内最早将亲子鉴定实验中的16个STR位点用于遗传病产前分子诊断,在检测羊水样本的STR位点排除母体DNA污染的同时,判断突变基因的来源,发现新生突变。

17α羟化酶17,20碳链裂解酶缺陷症家系分子诊断研究

目的 对17α羟化酶17,20碳链裂解酶缺陷症（17OHD）1个家系4人进行分子诊断。方法 对2013年南京军区福州总医院收治的17OHD患者及其母亲、小姨和妹妹全血中抽提基因组DNA,设计8对引物,采用PCR扩增产物直接测序方法进行基因突变分析。结果 先证者的临床表现符合17OHD,其家族中未有其他病例。先证者序列分析表明,其CYP17A1基因第8外显子存在9个碱基（GACTCTTTC）缺失,导致第487-489位氨基酸缺失,使P450c17酶完全失活,从而导致17OHD。其母亲和小姨为该位点杂合缺失,妹妹未检测到同一缺失。结论 建立了基于CYP17A1基因突变分析的分子诊断方法,可以对17OHD进行准确的分子诊断,并可为遗传咨询及其产前诊断奠定基础。

四例男性不育患者的15q11额外小标记染色体分析

目的对4例男性不育患者所携带的额外小标记染色体（small supernumerary marker chromosome，sSMc）进行定位分析，以探讨其对男性不育的影响。方法综合应用外周血培养染色体核型G显带、N显带、多重连接依赖探针扩增（multiplex ligation dependent probe amplification，MLPA）、荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization，FISH）、单核苷酸多态性芯片（single nucleotide polymorphisms array，SNP—array）等技术对4例男性不育患者的15q11额外小标记染色体进行分析。结果G显带分析显示4例患者染色体核型均为47，XY，＋mar。N显带分析提示sSMC均为双随体，位于mar两侧。MI，PA（SALSA着丝粒探针p180／p182试剂盒）分析提示，1例患者的15q11．2基因拷贝数重复。SNP-array分析提示，4例患者均为15q11．1-q11．2区重复，片段大小分别为3．06Mb、0．9118Mb、1．728Mb、0．287Mb。CEP15D1524着丝粒探针FISH分析mar均有2个杂交信号，为双着丝粒染色体。综合分析4例患者mar均来自15号染色体，为双随体、双着丝粒，倒位重复形式，分子细胞核型为47，XY，＋mar．ishinvdup（15）（q11）（D1524＋＋）。结论15q11sSMC可能是导致男性不育的重要原因之一。

一例脊肌萎缩症患者及其家系的SMN基因突变分析

目的 对1例脊肌萎缩症（spinal muscular atrophy，SMA）患者及其家系成员的SMN基因行突变分析。方法 采用多重连接依赖性探针扩增（multiplex ligation-dependent probe amplification，MLPA）技术、逆转录聚合酶链反应及T克隆-测序技术对患者SMN基因进行拷贝数分析和点突变的鉴定，应用MLPA和针对点突变区域的SMN基因第5外显子PCR-直接测序法对患者父母SMN基因进行拷贝数分析和点突变的证实，同时用200名正常人外周血进行相关位点对照研究。结果 患者具有1个拷贝的SMN1基因和1个拷贝的SMN2基因，在这个SMN1基因第230位密码子上存在1个未见报道的错义突变S230L（TCA→TTA）；父亲具有两个SMN1和两个SMN2拷贝，其中1个SMN1基因存在S230L突变；母亲具有1个SMN1拷贝，而SMN2基因是纯合缺失的。200名对照中未发现该位点突变。结论 在1个SMA家系中发现了1个新的SMN1基因点突变，即S230L，并准确分析了此家系各成员的SMN基因型。

Y染色体无精子因子a区缺失伴三条染色体畸变无精子症一例

患者男性，31岁，结婚多年不育。身高、体重、智力及外阴发育正常。睾丸16mL[正常成年男性睾丸体积：（19．8±7．1）ml，]，3次精液检查均未见精子。血清雌二醇、促黄体激素、睾酮和泌乳素均正常．但促卵泡激素22U／L（正常参考值为5～20U／L）。

一例BP3：BP3重排inv dup（15）的临床表型和遗传学分析

目的联合多种遗传学技术鉴定1例标记染色体，并分析其基因组重排与临床表型的关系。方法应用G显带核型分析、多重连接依赖性探针扩增技术、荧光原位杂交和单核苷酸多态性芯片对标记染色体进行分析。结果G显带核型分析为47，XX，＋mar。多重连接依赖性探针扩增技术分析提示15q近端重复。荧光原位杂交检测标记染色体来源于15号染色体，含双着丝粒。单核苷酸多态性芯片显示15q11-13增加了两个拷贝数，重复区域位于20161372-29071810。结论Prader—Willi／Angelman综合征关键区拷贝数增加可能是导致BP3：BP3重排inv dup（15）异常表型的主要原因。

一个家族性腺瘤性息肉病家系的APC基因突变分析

目的对1个家族性腺瘤性息肉病（familial adenomatous polyposis,FAP）家系的腺瘤性息肉病（adenomatons polyposis coli,APC）基因进行突变分析。方法通过临床表现、家族史、大肠息肉数、组织病理学等，临床诊断1例FAP患者。提取先证者外周血DNA，进行APC基因所有外显子的PCR扩增及序列分析，发现突变位点后，对先证者的家庭成员进行相应突变位点检测，并对相应PCR产物进行酶切验证，同时用酶切方法对100名无血缘关系的正常对照进行检测。结果该家系发现一新的无义突变：C．2891T〉G（L964X），该突变国际上未见报道。这一突变造成终止密码子提前出现，在100名无血缘关系的正常人中均未发现此突变。结论C．2891T〉G（L964x）为该家系的致病性突变。本研究采用测序技术和酶切方法相结合，确保了诊断的准确性。