转化生长因子-β2在小鼠过敏性气道炎症及重塑中的作用与干预潜能

目的探讨转化生长因子-β2(transforming growth factor-β2,TGF-β2)在过敏原引起的哮喘气道炎症和重塑中的作用及其靶向干预的治疗潜能。方法以呈现TGF-β2肽表位的乙型肝炎病毒核心抗原(HBcAg)/TGF-β2病毒样颗粒(virus-like particles,VLPs)免疫6只雌性BALB/c小鼠,ELISA法检测小鼠血清中TGF-β2特异的IgG应答,细胞试验检测抗体对TGF-β2活性的中和能力。卵清白蛋白(ovalbumin,OVA)短期刺激诱导急性气道过敏性炎症,细胞试验检测小鼠支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF)中TGF-β活性水平;ELISA法检测小鼠血清中OVA特异的IgE水平;光学显微镜下进行BALF中炎性细胞总数及分型计数,并用ELISA法检测BALF中细胞因子水平。经OVA慢性刺激诱导气道纤维化,肺组织切片Masson’s trichrome检测胶原积累,并用Sircol胶原检测试剂盒进行可溶性胶原含量定量分析。结果VLPs免疫诱导了TGF-β2特异性IgG应答,抗血清可有效中和TGF-β2活性。小鼠急性气道过敏性炎症模型中,VLPs免疫下调了气道活性TGF-β水平,显著促进了血清中OVA特异性IgE产生,对气道以嗜酸性粒细胞为主的炎性细胞浸润显示抑制作用,显著促进了Th2炎性细胞因子在气道中的积累。慢性肺纤维化模型中,VLPs免疫显著下调了肺组织胶原沉积及可溶性胶原水平。结论HBcAg/TGF-β2 VLPs免疫是调控TGF-β2作用的有效手段,TGF-β2在过敏原诱导的炎症应答中总体显示抑制作用,但在纤维化中发挥促进作用。

过敏原卵清白蛋白诱导慢性哮喘小鼠模型的建立及其免疫应答特征的动态分析

目的 建立过敏原卵清白蛋白(ovalbumin,OVA)诱导的慢性哮喘小鼠模型,并对该模型免疫应答特征进行动态分析。方法 以OVA经腹腔致敏22只雌性BALB/c小鼠,并经鼻腔反复滴注刺激气道反应,于不同时间点取样进行分析。收集小鼠支气管肺泡灌洗液,进行炎性细胞计数;取灌洗液离心上清,ELISA法检测多种相关细胞因子水平。取小鼠肺组织,制备切片,苏木精-伊红(hematoxylin-eosin,HE)染色法检测肺组织炎性细胞浸润情况,高碘酸-希夫(periodic acid-Schiff,PAS)染色法检测气道上皮杯状细胞增生情况;马松三色(Masson′s Trichrome)及Sircol染色法检测肺组织胶原积累情况。采集小鼠静脉血,分离血清,ELISA法检测血清中OVA特异的IgE、IgG1、IgG2a水平。应用FlexiVent小动物肺功能仪的强制低频振荡模式分析小鼠气道反应性。结果 OVA的反复刺激成功诱导了小鼠气道及肺组织炎性细胞应答、炎性细胞因子积累、气道杯状细胞增生、肺组织纤维化、过敏原特异IgE抗体应答、气道高反应性等哮喘典型指标,且呈现不同应答特征。随着OVA反复刺激,炎性细胞应答、杯状细胞增生有所下降,但胶原沉积增加,而气道的高反应性在末次刺激4周后仍存在。转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)伴随炎性应答的持续呈高表达,TGF-β2及白介素-33(interleukin-33,IL-33)在末次刺激4周后才呈高水平表达。结论 本研究采用OVA持续刺激诱导建立了慢性哮喘小鼠模型,并展现了该模型的免疫应答特征,为慢性哮喘机制的研究、治疗靶点及药物研发奠定了基础。

氢氧化铝佐剂吸附肠道病毒71型灭活病毒的特性

目的探讨氢氧化铝佐剂吸附肠道病毒71型(enterovirus 71,EV71)灭活病毒的特性。方法采用透射电镜、凝胶排阻层析高效液相色谱(size exclusion chromatography HPLC,SEC-HPLC)及动态光散射(dynamic light scatter,DLS)技术分析灭活EV71颗粒的形态、纯度及粒径分布,并以透射电镜观察氢氧化铝佐剂纳米颗粒形态。以灭活EV71抗原含量(4000、6000、8000、10000、11000、12000、13000、14000、20000、30000 U/mL)、氢氧化铝佐剂浓度[0.35、0.25、0.17、0.085 mg/mL(按铝含量计)]、吸附时间(0、30及120 min)、离子强度(NaCl浓度0.15、0.75和1.25 mol/L)及磷铝摩尔比(P/Al,0.15、0.64、2.08及7.87)为变量,考察氢氧化铝佐剂吸附灭活EV71抗原后所呈现的吸附特性。结果灭活EV71颗粒主要以完整的病毒颗粒形式存在,直径约30 nm;氢氧化铝佐剂具有纳米化的特征,粒径分布在200~700 nm之间。≤11000 U/mL浓度的灭活EV71抗原可被0.35 mg/mL(按铝含量计)的氢氧化铝佐剂完全吸附,上清中未检测到游离抗原,从12000 U/mL起,随抗原量的增加,上清中游离抗原含量也增加;各浓度氢氧化铝佐剂能完全吸附250 U/mL的灭活EV71抗原,上清中未检测到游离抗原,不同孵育时间的吸附效果一致。在单剂量疫苗氢氧化铝含量(0.35 mg/mL,按铝含量计)及灭活EV71抗原含量(250 U/mL)条件下,NaCl离子强度对灭活EV71吸附无影响,而磷酸离子浓度明显影响吸附。结论单剂量疫苗中的氢氧化铝佐剂可完全吸附灭活EV71抗原,基团置换在其中发挥了重要作用。

肠道病毒71型灭活疫苗灭活验证超速离心条件的优化

目的优化肠道病毒71型(enterovirus 71,EV71)灭活疫苗灭活验证超速离心条件,为EV71灭活疫苗灭活验证样品的处理提供实验依据。方法在不同转速(45 000、40 000、35 000、30 000、25 000 r/min)和时间(120、90、60、30 min)条件下对EV71收获液进行超速离心,检测离心前和离心后病毒液的滴度,计算回收率,比较不同条件下离心前后病毒回收效果。结果在转速相同或离心时间相同的条件下,EV71的沉淀效果与离心时间或离心转速呈正相关(R^2从0.77和0.88分别增大到0.99),其中,当离心转速超过40 000 r/min时,不同离心时间下病毒的回收率均在90%以上,当离心时间为120 min,离心转速为45 000 r/min时,病毒的沉淀效果最好,回收率最高,达98%。综合离心时间因素,选择离心条件为45 000 r/min-60 min较适宜(回收率为97%),与45 000 r/min-120 min相比,差异无统计学意义(P>0.05);如将时间减为45 000 r/min-30 min,与其他3组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 EV71的沉淀效果与离心转速和离心时间呈正相关,即随着离心转速增大和离心时间的延长,病毒的沉淀效果越好、回收率越高。

靶向IL-4主动免疫抑制屋尘螨抽提物诱导的小鼠气道炎症反应

以IL-4为主要驱动的Th2应答是过敏性哮喘的主要免疫病理特征,该文旨在探讨靶向IL-4主动免疫对屋尘螨过敏原刺激的小鼠气道炎症反应的干预作用及潜力。研究以重组制备的、呈现IL-4肽表位的乙肝核心抗原病毒样颗粒免疫BALB/c小鼠,并以屋尘螨抽提物诱导气道过敏性炎症反应。结果显示,靶向IL-4的主动免疫激发了持续的IL-4特异IgG抗体高水平应答;显著减少气道浸润的总炎性细胞以及其中占主要的嗜酸性粒细胞数目;显著降低了支气管肺泡灌洗液中Th2细胞因子IL-4、IL-13和IL-5水平,而Th1的IFN-γ有升高趋势;显著下调了血清IgG1而上调IgG2a水平;此外,显著抑制了乙酰甲胆碱刺激的过敏小鼠气道高反应性。研究表明,靶向IL-4的主动免疫具有抑制过敏性气道炎症反应的潜力。

肠道病毒71型抗原检测板不同保存方法稳定性的比较

目的比较干燥保存及湿保存肠道病毒71型(enterovirus 71,EV71)抗原检测板的稳定性。方法用羊抗EV71多克隆抗体包被96孔酶标板,制备20块EV71抗原检测板,10块板置空气干燥后真空包装,-25℃保存;另外10块板用洗涤液浸泡,封口后置4℃保存。分别于保存0、20、40、60、90、120、180 d时,检测5份EV71样品。结果干燥保存EV71抗原检测板检测5份样品7个时间点的均值分别为315.0、299.4、7795.3、827.6、261.4 U/mL,湿保存的EV71抗原检测板检测结果均值分别为354.3、347.1、6766.6、749.7、277.3 U/mL,各时间点两种方法检测结果差异无统计学意义(P>0.05)。两种方法保存180 d时,EV71抗原检测板均可保持较好的活性(P>0.05)。结论两种方法保存EV71抗原检测板6个月内,均具有良好的稳定性。

四参数模型和平行线分析法在病毒疫苗抗原生物检定统计中的应用

摘要 目的 比较四参数模型与平行线分析法在Sabin株脊髓灰质炎灭活疫苗（Sabin inactivated poliovirus vaccine，sIPV）D抗原和肠道病毒71型（enterovirus 71，EV71）抗原生物检定统计中的应用。方法 对sIPV-D抗原和EV71抗原检测数据分别进行四参数模型和平行线分析法的方法验证，并将两种方法应用于不同含量样品检测结果的分析计算。结果 sIPV-D抗原检测数据四参数曲线拟合度好（决定系数为0.998，残差值≤0.059），平行性分析可靠（线性回归：参比品F=727.49，P〈0.01；样品F=1 169.44，P〈0.01。平行性方差分析F=0.24，P〉0.05）。EV71抗原四参数曲线拟合度好（决定系数为1.000，残差值≤0.025），平行性分析可靠（线性回归：参比品F=126.63，P〈0.01；样品F=192.74，P〈0.01。平行性方差分析F=4.00，P〉0.05）。对于sIPV和EV71不同抗原含量的生物检定统计，两种方法计算结果的差异无统计学意义（t=0.248～1.023，P值均〉0.05）。 结论 四参数模型和平行线分析法均能较好地应用于sIPV-D抗原和EV71抗原的ELISA检测体系。