抗原冲击致敏的树突状细胞介导的特异性体外抗慢性粒细胞白血病细胞作用

为研究慢性粒细胞白血病 (CML)细胞冻融抗原 (CLA)致敏的树突状细胞 (DC)对特异性抗白血病的作用 ,将CML患者外周血单个核细胞来源的DC在体外用CLA致敏 ,再与CML患者的经细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)共同培养。应用乳酸脱氢酶释放法观察其对自身CML细胞 ,K5 6 2细胞和Raji细胞的杀伤活性 (CIK +CLA DC组 ) ,与未致敏的DC +CIK(CIK +DC组 ) ,CIK组及CIK +CLA组进行比较。结果表明 ,效靶比为 2 5∶1时细胞杀伤活性最强 ,在该效靶比下 ,4组细胞对自身CML细胞的杀伤活性分别为 (6 8 8± 14 2 ) % ,(5 2 5± 9 4 ) % ,(2 0 7± 7 5 ) %和 (2 4 2± 8 7) %。CIK +CLA DC组杀伤活性最强 ,与其余 3组比较有显著性差异 (P <0 0 1) ;CIK +DC组比CIK组杀伤活性强 (P <0 0 1) ;CIK组与CIK +CLA组比较无显著性差异 (P >0 0 5 )。CIK +CLA DC组在效靶比为 2 5∶1时对自身CML细胞 ,K5 6 2细胞和Raji细胞的杀伤活性分别为 (6 8 8± 14 2 ) % ,(14 6± 6 2 ) %和 (12 7± 10 2 ) % ,与K5 6 2细胞和Raji细胞比较 ,具有显著性差异 (P <0 0 1)。结论 :CIK对CML患者自身细胞具有一定的杀伤活性 ;CIK与CML DC共培养组对自身CML细胞杀伤活性比CIK组强 ;CIK与CLA抗原致敏CML DC共培养组具有最强的杀伤活性。

实时定量PCR检测46例初诊急性早幼粒细胞白血病患者PML/RARα mRNA的分子表达

本研究探讨实时定量PCR(Q-PCR)检测PML/RARαmRNA的方法学,并对46例初诊急性早幼粒细胞白血病(APL)患者骨髓标本进行检测。构建PML/RARα的bcr1型和bcr3型转录本以及内参照abl基因转录本的阳性标准品质粒;利用ABI Prism7500型Q-PCR仪对46例初诊APL患者和40例非APL患者骨髓标本进行检测,PML/RARαmRNA定量结果以校正比值(NQ)表示,NQ=PML/RARαmRNA拷贝数/ABLmRNA拷贝数;应用四色流式细胞术检测免疫表型。结果显示,Q-PCR结果的日间差和日内差平均变异系数(CV)分别为1.58%和0·88%。可重复敏感度为可以检测5copies/100ng RNA。40例非APL患者PML/RARαmRNA均为阴性。46例初诊APL患者PML/RARαmRNA表达量NQ中位值为0.450(0.084-1.082)。比较32例bcr1型和14例bcr3型两组患者的特征表明,PML/RARαmRNA NQ中位值分别为0.454(0.084-1.082)和0.386(0.151-0.848)(P>0·05)。形态学诊断M3v的患者比例分别为9.40%和48.96%(P<0.05);初诊时WBC中位数分别为2.15(0.2-59.6)和9·35(0.91-122.8)(P<0.05),而在性别、年龄、初诊时血红蛋白和血小板计数、骨髓中APL细胞比例、DIC指标等方面无差异。流式细胞仪术检测时,CD45/SSC射门情况下,APL细胞群分布可以分为两类:高侧向角(L-SSC,粗颗粒)和非高侧向角(NL-SSC,细颗粒)两类。bcr1型患者中85.70%表现为L-SSC,而bcr3型患者中64·29%表现为NL-SSC。结论:建立的Q-PCR方法稳定可靠,敏感度高;bcr1型和bcr3型APL患者的PML/RARαmRNA表达量无差异,bcr3型APL患者中形态学M3v比例和WBC数比bcr1型患者高;PML/RARα不同转录本类型和免疫表型以及细胞形态学之间有一定的相关性。

维甲酸和砷剂联合诱导急性早幼粒细胞白血病中PML-RARα表达上调不影响预后(英文)

急性早幼粒细胞白血病(APL)接受维甲酸和砷剂诱导治疗早期的分子动力学及其临床意义尚不清楚。本研究对32例初治APL进行动态检测,利用实时定量PCR和间期荧光原位杂交(FISH)方法检测PML-RARα转录本水平(PML-RARα/ABL)和细胞遗传学。结果表明,诱导14 d时PML-RARα转录本水平比治疗前显著升高(40.10%和57.74%,P<0.01),诱导28 d和巩固治疗结束时PML-RARα转录本分别为:6.97%和0%。在诱导治疗14 d和28 d分别有65.62%和31.25%患者发生PML-RARα转录本增加。治疗前、诱导14 d和诱导28 d PML-RARα拷贝数/每个APL细胞为0.9,2.2,1.4(PML-RARα/ABL×2/APL细胞%)。中位随访时间为22个月,32例患者均无复发。结论:PML-RARα表达上调是急性早幼粒细胞白血病接受维甲酸和砷剂联合诱导治疗过程中一个普遍现象,对疾病预后无影响。

慢病毒载体的改进及其在血液病基因治疗中的应用

慢病毒载体 (lentiviralvector,LV)具有可感染非分裂细胞、转移基因片段容量较大、目的基因表达时间长、不易诱发宿主免疫反应等优点 ,成为目前较有前途的病毒载体。本文以人类免疫缺陷病毒Ⅰ型 (HIV Ⅰ )为代表 。

CD4^+CD25^+T细胞:一类新被认识的免疫调节细胞

CD4 + CD2 5 + T细胞是最近才被认识的一类免疫调节细胞 ,在胸腺产生 ,主要发挥抑制性免疫调节功能 ,表达IL 1 0mRNA ,细胞表面表达IL 2受体α链 (CD2 5 ) ,本身不产生IL 2 ,但在体内、外增殖需要外源性IL 2 ,在体外为无能细胞 (anergycell) ,CD4 + CD2 5 + T细胞发挥免疫抑制作用是通过细胞-细胞接触依赖方式而非细胞因子依赖方式 ,CD4 + CD2 5 + T细胞在调控自身免疫性疾病的发生、炎症反应和T细胞稳态中发挥重要作用。本文拟对CD4 + CD2 5 +

基因洽疗中慢病毒载体的最新进展

基因治疗有望成为治疗遗传病、感染性疾病及肿瘤的有效手段。高效的基因转移方法为基因治疗的关键,目前应用最广的是来源于致瘤型逆转录病毒为代表的简单的逆转录病毒载体,但该类载体不能有效地转染非分裂细胞如造血干细胞及终末分化的神经细胞等。以人类免疫缺陷病毒Ⅰ型(HIV-Ⅰ)为代表的慢病毒为复杂的逆转录病毒。慢病毒载体具有可感染分裂细胞及非分裂细胞、转移基因片段容量较大、目的基因表达时间长、不易诱发宿主免疫反应等优点,已成为当前基因治疗中载体研究的热点。近年来对其基本生物学特性、载体改造及其应用研究均取得了较大进展。

慢性粒细胞性白血病抗原负载树突状细胞激发的抗白血病作用

目的 研究慢性粒细胞性白血病 (CML)细胞冻融抗原 (CLA)负载的树突状细胞 (DC)对特异性抗白血病T细胞的作用。方法 将CML患者外周血单个核细胞 (PBMNC)来源的DC在体外用CLA负载 ,再与CML患者的经细胞因子诱导的杀伤细胞 (CIK)共同培养 ,应用乳酸脱氢酶 (LDH)释放法观察其对自身CML细胞杀伤活性 (A组 ) ,与未负载的DC +CIK(B组 )、CIK(C组 )及CIK +CLA(D组 )进行比较。结果 效靶比为 10∶1条件下 ,A、B、C、D 4组的杀伤活性分别为 (6 3 6 9± 8 35 ) %、(4 5 0 2± 5 49) %、(2 7 2 8± 4 6 4) %、(2 9 6 3± 5 71) %。A组比B组杀伤活性强 (P <0 0 1) ;C组与D组比无显著性差异。

慢性粒细胞白血病树突状细胞的体外定向诱导扩增及鉴定

目的 体外定向诱导扩增慢性粒细胞白血病 (CML)患者外周血单个核细胞 (PBMNC)来源的树突状细胞 (CML -DC)并测定其表型。方法 取CML患者新鲜抗凝血 ,用淋巴细胞分离液分离PBMNC ,经细胞因子rhGM-CSF、rhIL - 4、rhTNF -α联合刺激培养 9～ 12d ,收集培养细胞 ,光镜形态学分析并细胞计数 ,结合PE -CD1a单抗、FITC -CD14单抗在流式细胞仪 (FCM)上进行CML -DC比例及表型分析。结果 CML患者PBMNC经以上细胞因子联合培养 ,CML -DC含量可达 3.5 %～ 2 3.5 % ,而新鲜分离的CML患者PBMNC中CML -DC含量仅为0 .1%～ 1%。结论 CML患者PBMNC经体外定向诱导扩增培养可以生成较多的CML -DC ,从而为CML的免疫治疗应用于临床提供了基础。

CD123在急性早幼粒细胞白血病微小残留病检测中的应用

为了探讨CD123联合应用其它免疫标志检测急性早幼粒细胞白血病(APL)中微小残留病(MRD)的作用及意义,采用四色流式细胞术(FCM)分析了186例初诊APL患者的免疫表型特点及20例正常骨髓中与APL细胞表型相同的细胞所占比例,并应用以CD34/CD117/CD123/HLA-DR为主的4色抗体组合对172份标本进行MRD检测并与实时定量PCR结果相比较。172份标本包括19例连续随访APL患者的116份骨髓或外周血标本和47例距初诊3个月至2年不等的非连续随访患者的56份骨髓标本,其中形态学完全缓解(CR)后117份,CR前55份标本。对18份标本同时加做抗体组合CD9/CD117/CD34/CD33检测。结果表明:初诊APL患者除高表达CD9、CD33、CD117和低表达CD34、HLA-DR外,CD123的阳性表达率为100%(30/30);正常骨髓中CD117+CD34-CD123+HLA-DR-细胞和CD117+CD34-CD9+CD33+细胞在有核细胞中的比例分别为(0.066±0.012)%和(0.089±0·066)%,与APL患者相比相差4个对数级;随访期内,19例患者全部获得形态学CR,中位时间为4周(3-6周),13例FCM结果转阴的中位时间为7.5周(5-11周),11例PCR结果转阴的中位时间为8周(5-12周);形态学CR后随访的117份标本中41份FCM检测MRD呈阳性,8份标本CD117+CD34-CD123+HLA-DR-细胞比例>5%,中位值为9.02%(5.26%-18.14%),33份标本CD117+CD34-CD123+HLA-DR-细胞比例<5%,中位值为0·48%(0.02%-4.70%);CD117+CD34-细胞中CD123+HLA-DR-细胞的中位相对比例分别为86.77%(63.29%-92.62%)和63.59%(15.11%-98.36%);FCM与PCR同时检测MRD结果显示,FCM(+)标本中95.9%(93/97)PCR为阳性,FCM的假阳性率为4.1%(4/97),PCR的假阴性率为8.75%(7/93)。FCMMRD(-)标本中,92%(69/75)PCR阴性,8%(6/75)为PCR阳性。连续随访的116份标本和形态学CR后的117份标本显示,CD117+CD34-CD123+HLA-DR-细胞比例与实时定量PCR检测的mRNA水平基本一致,两者均有一定的相关性(r=0.824,P<0.001和r=0.754,P<0.001)。结论:应用CD34/CD117/CD123/HLA-DR为主的2组4色抗体组合检测APL患者中的MRD简单可行,可与PCR检测相互补充。

多参数流式细胞术分析415例成人和儿童B-ALL白血病相关免疫表型

为了探讨FCM在微量残留病(MRD)检测中的意义,利用4 -6组4色抗体组合,以CD45/SSC设门法对273例成人和142例儿童B系急性淋巴细胞白血病(B-ALL)患者进行了多参数流式细胞术(FCM)免疫分型检测和白血病相关免疫表型(leukemia associated immunophenotyping, LAIP)分析。结果表明:根据CD34和CD10的表达特点,可将B-ALL患者分为I型(CD34+CD10-);Ⅱ型(CD34+CD10+);Ⅲ型(CD34-CD10+);Ⅵ型(CD34-CD10-)。Ⅰ型和Ⅱ型患者LAIP的阳性比例分别为100%和92%,但Ⅲ型患者LAIP阳性率只有79.2%,显著低于Ⅰ型和Ⅱ型患者。总体B-ALL患者LAIP的检出率为90%,成人与儿童组无明显差异。而利用CD34/CD10/CD19/CD45一组抗体,LAIP检出率达到77.6%。结论: 90%成人和儿童B-ALL白血病患者具有LAIP,因此对这类患者适宜用多参数流式细胞术进行MRD监测。

221例急性早幼粒细胞白血病免疫表型特点与微小残留病检测及基因标志的关系

本研究探讨急性早幼粒细胞白血病(APL)患者的免疫表型特点与微小残留病(MRD)检测及基因标志之间的关系。采用四色流式细胞术(FCM)分析了221例初诊APL患者的免疫表型,其中87例加做CD123抗体,196例同时运用PCR检测特异融合基因pml-rarα。结果发现:初诊APL患者中CD123、CD33和CD9的阳性表达率分别为100%、99.1%和96.0%,阳性患者中平均阳性细胞比例均在90%左右;虽然CD117、CD13、CD38及CD64的阳性表达率均高于96%,但阳性患者中阳性细胞比例分布不一致,平均阳性细胞比例在70%左右;部分患者表达CD15、CD56和CD11b,多数患者不表达CD34和HLA-DR,阳性患者中阳性细胞的平均比例均较低。196例初诊APL患者中,pml-rarα基因的不同转录本bcr1、bcr2和bcr3所占比例分别为63.3%、4.6%和32.1%。bcr3型基因与CD34的阳性表达相关,以20%为界时bcr3和bcr1型中CD34+患者的比例分别为15.4%(10/65)和3.3%(4/121)(p<0.05);以10%为阳性界限,bcr3和bcr1型中CD34+患者的比例分别为47.7%(31/65)和5.8%(7/121)(p<0.001);其余抗原的表达无明显区别。APL细胞中CD34为阳性且表现为非高侧向角(NL-SSC)时高度提示基因为bcr3型。结论:APL患者的免疫表型具有独特特征,CD123、CD33和CD9更适用于APL的MRD检测,CD34的阳性表达、NL-SSC与bcr3基因亚型相关,CD34的阳性界限设为10%更能提示基因类型与抗原表达的关系。

慢性粒细胞白血病患者DC对细胞因子诱导的杀伤细胞细胞毒作用的影响

目的 观察慢性粒细胞白血病 (CGL)患者树突状细胞 (DC)对自身细胞因子诱导的杀伤细胞 (CIK)细胞毒的影响。方法 从CGL患者和正常人末梢血中分离单个核细胞 (PBMC) ,用细胞因子 (rhGM -CSF、rhIL - 4和rhTNF -α)联合定向诱导培养DC。用CGL细胞抗原致敏DC ,再将致敏的DC与CIK共同培养后 ,检测CIK对不同靶细胞的杀伤作用。结果 CGL患者和正常人的PBMC经细胞因子联合诱导培养后 ,DC占 2 0 7%～ 5 6 0 %。CGL患者的CIK和经CGL细胞抗原致敏的DC作用后的CIK ,对自身白血病细胞的杀伤活性分别为 5 6 0 %和 83 4 % ;正常人对照组则分别为 30 %和 6 2 %。经CGL患者CGL细胞抗原致敏的DC作用后的CIK ,对K5 6 2和SGC 790 1的杀伤活性较未致敏的CIK活性低 ,而正常人对照组则无此现象。结论 从CGL患者的PBMC中能定向诱导扩增出DC。经CGL细胞抗原致敏的DC 。

多参数流式细胞术检测急性髓系白血病微量残留病的预后意义

本研究探讨多参数流式细胞术检测急性髓系白血病(AML)微量残留病(MRD)的方法和预后意义。采用4色标记的5组抗体组合确定初治患者的白血病相关免疫表型(LAIP),选取敏感的LAIP进行追踪MRD,共检测了随访95例AML患者的601份骨髓标本。以患者LAIP阳性细胞比例高于正常值+2倍标准差的定为MRD(+),低于此值的为MRD(-)。结果发现:以开始诱导化疗后半年内每2个月分为3组,3组中MRD(+)患者与MRD(-)患者之间的复发率和无复发生存率均具有显著性差异(p<0.05),1-2个月、3-4个月和5-6个月MRD(+)组的中位无复发生存期分别是11、11.5和11个月,MRD(-)组均未达中位生存期(p<0.05)。进一步比较诱导缓解后与巩固治疗1个疗程后患者MRD检测结果与临床的关系,发现这两个时间点MRD(+)组和MRD(-)组的患者复发率分别为57.14%与0%和91.67%与2.27%(p=0.000和p=0.000)。结论:多参数FCM检测MRD能够有效预测复发,治疗后应连续进行MRD检测。

Ⅱ类抗原反式激活因子与HLA-DR抗原的关系及其意义(英文)

本研究探讨Ⅱ类抗原反式激活因子(CIITA)和人类白细胞抗原(HLA-DR)表达时相的关系和差异,及STAT1-α反义寡核苷酸(STAT1-αAS)对CIITA和HLA-DR的抑制作用。分离健康志愿者外周血T淋巴细胞,给予不同剂量干扰素-γ(IFN-γ)后,用RT-PCR法检测CIITAmRNA,Westernblot分析HLA-DR抗原表达,然后给予不同浓度STAT1-αAS和STAT1-α寡核苷酸有义链(STAT1-αS),再次检测CIITAmRNA和HLA-DR的表达。结果表明:CIITAmRNA在IFN-γ作用后5小时开始表达,14小时达峰值;HLA-DR在28小时后可被检测出,52小时达高峰。5、10和20μmol/LSTAT1-αAS作用于细胞后,CIITAmRNA的表达显著低于对照组(P<0.01),而在S组明显高于AS处理组(P<0.01),S组与对照组间无显著差异;HLA-DR的表达可被STAT1-αAS抑制,AS组仅为对照组的64.3%(P<0.01),S组与对照组间仍无差异;STAT1-αAS作用后,HLA-DR变化同CIITA。结论:CIITAmRNA表达与HLA-DR表达呈正相关且早于后者;STAT1-αAS可特异性抑制CIITA和HLA-DR的表达,并能预防T淋巴细胞激活,CIITA在移植免疫病因中起重要作用。

55岁以上中老年急性淋巴细胞白血病患者的临床特征与疗效分析

目的：分析中老年急性淋巴细胞白血病（acute lymphoblastic leukemia, ALL）患者的临床特征与疗效。方法：回顾性分析2000年1月至2012年7月北京大学人民医院血液病研究所连续收治的≥55岁ALL患者45例。根据患者脏器功能，分别接受CVDP/VDP/VP诱导化疗，达到完全缓解（complete remission, CR）的患者接受巩固化疗和维持化疗或随诊观察，有合适供者行异基因造血干细胞移植（allogeneic hematopoietic stem cell transplantation, allo-HSCT）。评估患者CR率，分析患者总生存时间（overall survival, OS）、无疾病生存时间（disease free survival, DFS）及累计复发率。结果：45例≥55岁ALL患者占同期470例ALL患者的9.6%，其中B-ALL占88.9%。第1次诱导化疗后27例获得CR，总CR 33例。与55~60岁患者相比，大于60岁患者总CR减低（86.2% vs. 50%；P=0.009）。45例患者2年OS 率为33.7%，中位OS为 12个月（95% CI 6.68~17.32）。55~60岁（P=0.014）、进行巩固治疗（P=0.001）及CR（P=0.002）是独立影响OS的有利因素。33例获得CR的患者中，2年DFS率为39.7%。CVDP诱导化疗方案（P=0.013）及进行巩固治疗（P=0.049）是独立影响DFS的有利因素。结论：中老年ALL患者预后较差，55~60岁、CR、CVDP诱导化疗方案及进行巩固治疗是独立的改善预后因素。

四硫化四砷诱导急性早幼粒细胞凋亡的机制

目的:研究四硫化四砷在抗急性早幼粒细胞白血病中诱导细胞凋亡的分子机制。方法:应用cDNA微矩阵技术检测四硫化四砷作用前后NB4细胞基因表达图谱。筛选出有差异表达的与细胞凋亡相关蛋白类基因,合成相应的引物,用RTPCR方法检测口服四硫化四砷的急性早幼粒细胞白血病(APL)患者缓解前后外周血细胞凋亡相关蛋白类基因的表达,分析四硫化四砷诱导早幼粒细胞凋亡的途径。结果:通过基因微矩阵技术分析发现,四硫化四砷作用NB4细胞有差异表达的细胞凋亡相关蛋白类基因包括编码凋亡蛋白酶活化因子基因(Apaf1),比值为2.910;编码细胞凋亡相关蛋白PNAS2基因,比值为0.420。RTPCR检测口服四硫化四砷APL患者缓解前后外周血Apaf1比值2.33,caspase9比值3.21,PNAS2比值0.99。结论:四硫化四砷对NB4细胞的细胞凋亡效应主要涉及两个基因表达的改变:细胞凋亡蛋白酶活化因子(Apaf1)基因的表达上调和细胞凋亡相关蛋白PNAS2基因表达的下调。APL患者PNAS2基因表达没有明显的改变,可能与使用其他药物的影响有关。Apaf1和caspase9表达相应的增高提示,四硫化四砷诱导APL细胞凋亡可能是通过以线粒体介导的凋亡通路为主的活化途径,而不是通过死亡受体途径。