耐辐射球菌pprI在大肠杆菌中表达增强细胞抗氧化能力的研究

将耐辐射球菌 (Deinococcusradiodurans)与DNA修复有关的开关基因—pprI通过穿梭质粒pRADZ3导入大肠杆菌TG1中 ,使其在正常培养条件下 (不需诱导剂 )表达PprI蛋白 ,并通过Westernblot证实该基因在TG1中可稳定表达。与转化了空白质粒pRADZ3TG1对照 ,观察了改造后的两种大肠杆菌在有H2 O2 氧化压力下的存活率和大肠杆菌中两种过氧化氢酶 (KatE ,KatG)的活性表达差异。结果表明 ,无论在指数生长期还是稳定生长期 ,能表达PprI蛋白的大肠杆菌比对照的存活率要高出 1 0 %左右 ;非变性电泳结果表明 ,耐辐射球菌pprI在大肠杆菌中的表达使得KatE活性在指数生长期与稳定生长期分别增加 1 5～ 2倍和 2 5～ 3倍。

鼻咽癌患者鼻咽拭子中EB病毒LMP1基因C末端的变异及序列分析

目的研究LMP1基因C端区在宁波地区鼻咽癌患者中的变异状况,并探讨其在鼻咽癌中所起的作用。方法通过鼻咽拭子的方法采集鼻咽癌患者的病变黏膜上皮及分泌物,采用聚合酶链反应(PCR)扩增鼻咽癌患者鼻咽拭子中的LMP1基因C末端,并对其进行序列分析。结果30例鼻咽癌患者的鼻咽拭子标本中有28例显示出阳性条带,且都存在序列变异,而正常对照标本无一扩增得到,特异性为100.0%。28例阳性标本中有7例标本存在30 bp的缺失突变,缺失率为25.0%。结论宁波地区的鼻咽癌鼻咽拭子中LMP1基因C端高变区30 bp的缺失型约占25.0%,不是主要流行型。

RNAi沉默RON基因对人结肠癌HT-29细胞侵袭和耐药性的抑制作用

目的:探讨RNAi沉默酪氨酸激酶受体RON(recepteur d’origine nantais)基因对人结肠癌HT-29细胞侵袭和对抗肿瘤药物敏感性的影响。方法:构建RON基因的RNAi慢病毒载体Lv-RON-siRNA。Real-time PCR和Western blotting检测RON基因的沉默效率及RON蛋白表达水平;Transwell侵袭实验和ATP-TCA(ATP-tumor chemosensitivity assay)检测RON基因对HT-29细胞侵袭和对药物敏感性的影响。结果:慢病毒载体Lv-RON-siRNA感染HT-29细胞对RON基因的沉默效果达到70%。Lv-RON-siRNA感染后,HT-29细胞侵袭力较对照组明显降低(0.97±0.072 vs 1.29±0.076,P<0.05)。Lv-RON-siRNA感染后,HT-29细胞对5-氟尿嘧啶(5-fluorouraci,5-FU)的IC90值和IC50值分别为(14.28±1.34)、(8.93±1.20)μg/ml,顺铂(cisplatin,DDP)的IC90值和IC50值分别为(1.91±0.22)、(0.64±0.07)μg/ml,均明显低于对照组(P<0.01)。结论:沉默RON基因表达能抑制HT-29细胞的侵袭力,提高细胞对5-FU和DDP的敏感性。

鼻黏膜中Toll样受体5的表达

目的研究鼻黏膜中Toll样受体5(Toll-likereceptor-5,TLR-5)的表达以了解TLR-5在鼻黏膜天然免疫中的作用。方法鼻息肉和下鼻甲组织从接受鼻内镜手术治疗的慢性鼻及鼻窦炎和鼻中隔偏曲患者取得。应用免疫组化法检测17例鼻息肉和13例下鼻甲黏膜中TLR-5蛋白的表达,应用实时荧光定量RT-PCR(real-time fluorescentquantitative RT-PCR,real-time FQ-RT-PCR)检测14例鼻息肉和9例下鼻甲黏膜中TLR-5 mRNA的表达。结果在所有标本中均检测到TLR-5 mRNA和蛋白表达。免疫组化显示TLR-5蛋白主要表达于鼻黏膜上皮细胞和腺体上皮细胞。在细胞核和细胞浆中均有表达。在鼻黏膜上皮,染色最强的区域位于黏膜上皮表面一侧的细胞膜和细胞核。另外在间质单核样炎症细胞及NK细胞也有表达。鼻息肉组织中TLR-5蛋白表达指数5.529±0.653较下鼻甲2.346±0.619增高,差异有统计学意义(Z=-3.107,P=0.002)。结论本次研究确认了TLR-5在鼻黏膜和鼻息肉组织的表达,鼻息肉组织中TLR-5表达的增高可能与鼻息肉内持续的炎症状态有关。提示TLR-5有可能成为鼻息肉、慢性鼻及鼻窦炎一个新的治疗靶点。

慢病毒载体介导RNA干扰抑制大肠癌细胞HT29的酪氨酸激酶受体RON基因的表达

目的研究慢病毒介导的RNA干扰(RNAi)对大肠癌细胞RON基因的干扰效率,构建RON基因稳定沉默的大肠癌细胞株。方法应用实时聚合酶链反应(PCR)检测大肠癌细胞DLD-1、HCT116、LOVO、RKO、SW480、HT29的RONmRNA表达情况,筛选出表达丰度能满足RNAi的大肠癌靶细胞HT29。根据人RON基因序列,构建4种慢病毒载体质粒pGCSIL/RON-短发夹RNA(shRNA),转染包装细胞293T,获得4种重组慢病毒pGCSIL/RON-shRNA,分别感染HT29细胞。应用实时PCR检测各组HT29细胞RONmRNA表达情况,筛选出RON干扰效率最高的一种shRNA慢病毒载体质粒,构建RON基因稳定沉默的大肠癌细胞株HT29/RON-shRNA。结果 DLD-1、HCT116、RKO、SW480、HT29细胞RON表达丰度能满足RNAi的需要,选择HT29细胞作为RNAi的靶细胞。阴性对照病毒感染的细胞样品相对正常未感染病毒的细胞目的基因的相对表达水平为(94±5)%,RONshRNA-1靶点病毒感染的细胞为(86±5)%,RONshRNA-2靶点病毒感染的细胞为(67±6)%,RONshRNA-3靶点病毒感染的细胞为(63±6)%,RONshRNA-4靶点病毒感染的细胞为(30±8)%,RONshRNA-4靶点病毒感染的细胞的表达水平显著低于其他细胞(P值均<0.01),其对目的基因的沉默效果达到(70±8)%。结论慢病毒介导RNAi能显著抑制大肠癌细胞HT29的RON基因的表达,慢病毒载体介导的RNAi是一种高效的"基因沉默"的手段。

人乳腺癌细胞株MCF-7、MCF-7/ADM细胞迁移能力的对比研究

目的探讨乳腺癌细胞化疗继发耐药后细胞迁移能力的变化,并筛选出相关基因。方法以MCF-7细胞株为亲本细胞。采用阿霉素(ADM)低浓度持续加量诱导法建立对ADM耐药的人乳腺癌细胞株MCF-7/ADM。应用ATP-TCA药物敏感检测法和xCELLligence/RT-CES实时细胞电子分析系统检测人乳腺癌细胞株MCF-7、MCF-7/ADM对多种化疗药物的耐药情况及细胞增殖能力。应用Transwell实验和xCELLligence/RT-CIM实时细胞电子分析系统检测人乳腺癌细胞株MCF-7、MCF-7/ADM的细胞迁移能力。应用比较基因组芯片筛选出人乳腺癌细胞株MCF-7、MCF-7/ADM DNA拷贝数4倍差异的基因。结果撤药培养150d后,MCF-7/ADM细胞较亲本细胞MCF-7的ADM耐药指数为72.9,对其他化疗药物无明显的交叉耐药性。MCF-7/ADM细胞迁移能力较MCF-7明显降低(P<0.05)。MCF-7/ADM有12种基因DNA拷贝数是MCF-7的4倍,MCF-7有6种基因DNA拷贝数是MCF-7/ADM的4倍。结论乳腺癌细胞化疗继发耐药伴随细胞迁移能力明显降低,其相关基因的DNA拷贝数亦有明显差异。

新辅助化疗对乳腺癌外周血微转移因子的影响

目的:观察新辅助化疗对乳腺癌外周血微转移因子的影响。方法:以48例具备新辅助化疗条件的乳腺癌患者为研究对象,采用RT-PCR技术,联合检测外周血中CK-19 mRNA、VEGF mRNA和hMAM mRNA的表达,观察新辅助化疗前后血微转移因子变化。结果:本组乳腺癌微转移因子阳性率在病理分级中差异无显著性意义(P>0.05);在分期中,分期越高阳性率越高(P<0.05);化疗方案可影响微转移因子阳性率的变化(P<0.01)。结论:通过检测乳腺癌患者外周血中微转移因子,有可能成为判断乳腺癌预后和指导治疗的指标。

ATP-TCA在大肠癌化疗药物敏感性检测中的应用

目的:评估ATP-TCA肿瘤药敏检测法指导制定大肠癌化疗方案的可行性。方法:应用ATP-TCA肿瘤药敏检测法,检测28例大肠癌手术标本和19例大肠癌外周血标本对8种常用抗肿瘤药物的敏感性。结果:大肠癌对抗癌药物的敏感程度存在着异质性,联合用药的敏感率高于单药。外周血标本和手术标本检测结果具有一致性,检测结果与临床疗效基本相符。结论:ATP-TCA肿瘤药敏检测法可用于临床制定大肠癌个体化的化疗方案。

自杀基因ePNP的克隆及在人肝癌细胞HepG_2的表达

目的构建含大肠杆菌的嘌呤核苷酸磷酸化酶(ePNP)DNA的重组逆转录病毒载体,观察ePNP基因在人肝癌细胞株HepG2的表达。方法用PCR法获得ePNP亚克隆,构建重组逆转录病毒载体pDsRed-ePNP,鉴定测序。脂质体法将逆转录病毒载体pDsRed-ePNP转染AmphoPackTM-293包装细胞,获得高滴度病毒并感染HepG2细胞。流式细胞术和荧光显微镜检测红色荧光蛋白(RFP)的表达。RT-PCR法检测ePNPmRNA的表达。ATP-生物荧光体外检测实验(ATP-TCA法)检测不同浓度Fludarabine对HepG2、HepG2/pDsRed和HepG2/ePNP细胞的杀伤作用。结果克隆的ePNP基因与文献报道一致,成功构建重组逆转录病毒载体pDsRed-ePNP。病毒包装后滴度为5E+4TU/mL。表达RFP的HepG2/ePNP阳性细胞率为97.1%。HepG2/ePNP细胞稳定表达ePNP。低浓度Fludarabine对HepG2/ePNP细胞毒效应明显。结论成功构建重组逆转录病毒载体pDsRed-ePNP,并且获得稳定表达ePNP基因的HepG2/ePNP人肝癌细胞株。

鼻咽拭子EBV-DNA测定对鼻咽癌放疗效果评价的意义

目的分析鼻咽拭子EBV-DNA检查在评价鼻咽癌放化疗疗效和预后中的意义。方法收集经病理确诊的初治鼻咽癌患者42例、鼻咽癌放疗后复查患者61例和20例非肿瘤对照人群的鼻咽拭子,用PCR方法测定EBV-DNA,观察EBV-DNA水平变化与预后的关系。结果42例初治患者鼻咽拭子EBV-DNA的检出率为100%,有37例于放疗49d内转阴,5例延迟转阴或持续阳性;61例放疗后复查患者检出率为13.1%(8/61),其中50例病情稳定者3例(8%)阳性,5例局部复发者4例阳性,6例远处转移者1例阳性;20例非肿瘤对照人群均阴性。结论鼻咽拭子EBV-DNA检测是判断鼻咽癌疗效及预后的一个简单有效的方法。

上皮–间质转化:肿瘤转移的重要调控机制

上皮–间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)是指上皮细胞在特定生理或病理情况下向间质细胞表型转变的过程。近年来发现,EMT与肿瘤转移密切相关,已成为当前生命科学研究的热点。研究证明,激活TGF-β、Wnt/β-catenin、Notch、Hedgehog、IL-6/STAT3以及NF-κB等信号通路,调控Snail1、Snail2、Twist1、Twist2、ZEB1和ZEB2等转录因子,可诱导EMT进程。此外,许多非编码RNA(如microRNA和lncRNA)也参与肿瘤EMT调控。揭示EMT的分子调控机制以及其与恶性肿瘤的关系,对于预防和治疗癌症具有重要意义。

Scinderin基因沉默对人胃癌细胞SGC-7901增殖、转移的影响

Scinderin是一种依赖Ca2+的肌动蛋白丝(F-actin)切割蛋白,在细胞分泌过程中发挥着重要作用。目前,针对scinderin在人类疾病尤其是肿瘤中的生物学功能研究报道的并不多。该实验通过构建scinderin-shRNA慢病毒载体并感染人胃癌细胞株SGC-7901,于荧光显微镜下观测感染效率,利用RT-qPCR和Western blot实验证实scinderin的沉默效果。运用实时细胞分析仪(RTCA)检测细胞的增殖能力,流式细胞术检测细胞周期变化,Transwell小室检测细胞的迁移能力。结果显示,将构建好的病毒载体成功转入了胃癌细胞SGC-7901。感染scinderin-shRNA病毒载体后,scinderin的mRNA和蛋白质表达水平均受到不同程度的抑制(P<0.01),细胞的增殖和迁移能力均显著降低(P<0.05),细胞周期阻滞在G2/M期。该研究表明,胃癌细胞SGC-7901中scinderin低表达能有效抑制细胞的增殖和转移能力,这也为scinderin在胃癌演化过程中的机制研究奠定了实验基础。

抑癌基因p15反义RNA高表达是急性髓系白血病细胞中的频发事件

目的探讨急性髓系白血病（acutemyeloidleukemia，AML）患者中抑癌基因p15反义RNA（p15AS）的表达及其临床意义。方法应用单链特异引物逆转录的实时定量PCR方法验证AML细胞系存在p15AS，分析43例AML患者和21例良性血液病患者（对照组）骨髓p15AS和p15mRNA的表达水平，并分析p15AS的表达量与AML临床特征的关系。应用流式细胞术检测AML患者和对照组骨髓中p15蛋白的表达。结果急性髓系白血病细胞系中存在p15AS高表达。与对照组相比，AML患者p15AS表达增加而p15mRNA表达下调（t=41．45，P=0．000；t=-24．76，P=0．000）。AML组骨髓细胞中p15蛋白的表达[13．2％（10．2％～18．50％）]较对照组E84．5％（80．25％～86．8％）]显著减少，差异有统计学意义（Z=-6．22，P=0．000）。P15AS表达水平与AML患者的性别、年龄、FAB分型、初诊白细胞计数、血小板数量、骨髓增生程度和细胞遗传学预后分组无相关性（均P〉0．05）。结论p15AS高表达可能是AML的常见事件，并可能在抑癌基因p15表观遗传沉默中具有重要作用。