宁夏地区牛乳肠球菌耐药性分析

【目的】了解宁夏地区奶牛正常乳汁和患乳腺炎乳汁中肠球菌的分布规律及其耐药特征,为宁夏地区奶牛乳腺炎疾病的抗菌药物合理使用提供参考。【方法】对宁夏地区16个规模化奶牛养殖场近3年来1154份乳汁样品(正常乳汁383份,患乳腺炎乳汁771份)进行肠球菌分离,采用形态学观察和生化试验对分离所获的496株肠球菌进行鉴定,通过K-B药敏纸片扩散法测定分离肠球菌菌株对青霉素(PG)、头孢唑林(CFZ)、庆大霉素(GEN)、四环素(TET)、红霉素(EM)、林可霉素(LCM)、链霉素(SM)和万古霉素(VCA)等8种药物的敏感性,并使用PCR方法对分离肠球菌菌株进行四环素类药物耐药基因(tetA、tetB、tetC、tetM)、大环内酯类药物耐药基因(mecA、ermA、ermB、ermC)以及林可胺类药物耐药基因(lsaA、lsaE、lnuG、lnuA)检测。【结果】从1154份乳样中共分离得到496株肠球菌,经鉴定分属6种肠球菌,分别是屎肠球菌、海氏肠球菌、粪肠球菌、蒙氏肠球菌、耐久肠球菌和鹑鸡肠球菌。其中屎肠球菌305株,占分离菌株总数的61.5%;海氏肠球菌124株,占分离菌株总数的25.0%;粪肠球菌27株,占分离菌株总数的5.4%;蒙氏肠球菌21株,占分离菌株总数的4.2%;耐久肠球菌15株,占分离菌株总数的3.0%;鹑鸡肠球菌4株,占分离菌株总数的0.8%。临床分离菌株对林可霉素、四环素、红霉素的耐药率分别达到95.8%,82.7%和80.2%,尤以耐7种药物的菌株为主,达230株(占耐药菌株的46.4%),最常见的耐药谱为PG+CFZ+GEN+TET+EM+LCM+SM。正常乳汁中分离的菌株主要为海氏肠球菌(检出率为73.8%),对林可霉素的耐药率最高(94.5%);患乳腺炎乳汁中分离的菌株主要为屎肠球菌(检出率为89.5%),对四环素的耐药率最高(97.0%)。496株临床肠球菌中有488株检测出携带耐药基因,检出率为98.4%;检测出乳源肠球菌不携带tetA、tetB、tetC、mecA、lnuG和lnuA耐药基因;携带ermA、ermB、ermC、tetM、lsaA和lsaE耐药基因,其携带率分别为51.0%,80.3%,33.2%,88.1%,41.6%和74.4%;最常见耐药基因谱为ermA+ermB+tetM+lsaE+lsaA。【结论】宁夏地区奶牛乳汁中肠球菌耐药性严重,且具有多重耐药性特征,给公共卫生带来潜在危害,应引起高度重视。

枸杞Lb14-3-3c基因克隆及转化马铃薯的研究

在开花植物中,14-3-3蛋白对植物生长发育具有重要的调控作用。本试验利用逆转录PCR(RT-PCR)技术,从宁夏枸杞宁杞1号花药中克隆了一个14-3-3蛋白家族基因Lb14-3-3c。利用荧光定量PCR技术分析Lb14-3-3c基因在花药发育不同时期的表达特征,构建Lb14-3-3c基因的植物过表达载体pCambia1305.1-35s-Lb14-3-3c(+)及植物抑制表达载体pCambia1305.1-35s-Lb14-3-3c(-),继而经农杆菌介导法将过表达载体转化马铃薯紫花白幼茎,获得了阳性转基因马铃薯植株。结果表明,Lb14-3-3c基因编码的蛋白与番茄处于进化树同一分枝上,亲缘关系最近。荧光定量PCR分析表明,该基因在枸杞各器官都有表达,在雄蕊中的表达量最高。在花药发育的各个时期均表达,且在小孢子母细胞时期表达量最高。成功将外源基因Lb14-3-3c载入含强启动子CaMV35s的植物表达载体中,并将该基因的植物过表达载体转化马铃薯,通过表型观察与PCR阳性鉴定得到5株转基因植株,发现转基因植株长势优于野生型植株,苗期野生型与转基因型淀粉含量相差不大,结薯期和成熟期转基因型马铃薯的叶片淀粉含量均高于野生型,且差异显著。本研究为进一步探讨Lb14-3-3c基因对枸杞花药发育过程中淀粉供能的调控提供了参考依据,并且为阐明Lb14-3-3c基因在植物发育过程中的功能及枸杞的分子遗传改良提供了研究基础。

重组克柔念珠菌14-3-3蛋白诱导奶牛乳腺上皮细胞炎症反应的分子机制

旨在研究重组克柔念珠菌(Candida krusei)14-3-3蛋白(rCK14-3-3)对奶牛乳腺上皮细胞(MAC-T)炎性反应的分子机制,为系统研究克柔念珠菌损伤奶牛乳腺上皮细胞的机制提供理论依据。采用原核表达的方法构建克柔念珠菌BMH 1基因重组质粒并转化入大肠杆菌BL21(DE3)中,经诱导表达纯化后进行Western blot鉴定;CCK-8法筛选rCK14-3-3蛋白对MAC-T的最适作用浓度和时间;Western blot检测rCK14-3-3蛋白对MAC-T的Toll样受体、MAPK信号通路、NF-κB信号通路主要蛋白相对表达量的影响;ELISA检测rCK14-3-3蛋白对MAC-T中相关炎性因子IL-1β、IFN-γ、IL-18、TNF-α、IL-6、IL-12相对表达量的影响。结果显示:成功构建了pET-21a-BMH1重组表达载体,经诱导表达纯化后获得有生物学活性的rCK14-3-3蛋白,纯度达90%以上,浓度为0.2 mg·mL^(-1)。与空白对照组相比,采用50μg·mL^(-1)的rCK14-3-3作用MAC-T,TLR2、TLR4、MyD88在1、3 h时表达量极显著升高(P<0.01),6 h时,TLR4表达量显著降低(P<0.05),TLR2、MyD88表达量无显著变化;p-JNK在1 h时的表达量无显著变化,3、6 h时极显著降低(P<0.01);p-ERK在1、3、6 h时的表达量显著或极显著升高(P<0.05,P<0.01);p-p38在1 h时的表达水平极显著降低(P<0.01),3、6 h时极显著升高(P<0.01);p-IκB-α、p-p65在1、3、6 h时的表达量均极显著升高(P<0.01)。IL-1β、IFN-γ、IL-18、TNF-α在作用1、3、6 h后均呈现出显著或极显著的上调趋势(P<0.05,P<0.01);IL-6在作用1、3 h后极显著上升(P<0.01),6 h后显著降低(P<0.05);IL-12在作用1 h后极显著上升(P<0.01),3、6 h后极显著降低(P<0.01)。本研究成功表达具有生物学活性的rCK14-3-3蛋白,该蛋白可通过TLR2/4-MAPK/NF-κB信号通路诱导MAC-T发生炎性反应,rCK14-3-3蛋白可作为引起MAC-T炎症的重要因子之一。

重金属介导的抗生素抗性基因接合转移研究进展

抗生素抗性基因(ARGs)在人类-动物-环境之间的跨界面传播和聚集已成为公共卫生和环境生态系统的主要问题,ARGs和携带这些基因的可移动遗传元件(MGEs)已被视为新出现的环境污染物。环境重金属介导的ARGs水平转移增加了ARGs在本土微生物中富集的潜在风险。目前,研究重金属及其它新污染物诱导的ARGs水平转移已成为环境及其相关学科领域的研究热点。该文综述了重金属作为共选择剂对环境中ARGs接合转移的影响,重点从分子生物学角度分析了重金属引起ARGs接合转移增加的相关机制。重金属介导的ARGs接合转移是ARGs丰度增加的主要原因,重金属引起的接合频率的变化主要与其浓度相关,与毒物兴奋效应一致。相关调控机制包括调节活性氧(ROS)的产生、启动SOS反应、增强细胞膜通透性以及影响接合转移相关基因的表达和ATP合成。阐明在污染环境中(复合)重金属以及重金属与抗生素协同,在不同环境条件下增强ARGs水平转移的机制是今后研究的关键方向,可为重金属介导的ARGs环境行为研究提供一定的参考。

银柴胡组织培养与植株再生体系的建立

银柴胡是著名的药用植物。以MS为基本培养基,银柴胡种子无菌培养获得外植体,通过添加不同浓度的6-苄基氨基嘌呤(6-BA)、萘乙酸(NAA)、6-呋喃氨基嘌呤(KT)、吲哚丁酸(IBA)等植物激素探究对银柴胡不定芽、不定根诱导的最佳激素配比,并进行炼苗与移栽试验。结果表明,银柴胡种子用15%NaClO处理10 min消毒效果最好,污染率仅为3.37%,萌发率为97.15%;不定芽诱导的最佳培养基为:MS+6-BA 1.5 mg/L+NAA 0 mg/L,诱导率为100%;诱导不定芽生根的最佳培养基为:1/2MS+6-BA 0.3 mg/L+IBA 0.5 mg/L,生根率可达90%;以组培瓶盖半开的方式炼苗5 d后移栽至基质土中,成活率达到100%。采用直接器官发生途径,成功建立了银柴胡组织培养与植株再生体系,研究结果为银柴胡良种繁育和遗传改良提供参考依据。