转解毒酶基因工程菌的解毒作用研究

用已构建的可降解有机磷酸酯等杀虫药剂的转解毒酶基因工程菌,测定了对特异性底物--乙酸萘酯---NA-和--乙酸萘酯---NA-的分解作用,证明该工程菌高效地表达了解毒酶基因.将该工程菌细胞固定化后,通过对--NA和--NA的降解实验,测定了固定化细胞的酶活.用固定化细胞降解有机氯酸酯类的三氯杀虫酯-7504-、拟除虫菊酯类的溴氰菊酯和有机磷酸酯类的毒死蜱,结果表明,固定化细胞对该3类杀虫剂均具有一定的降解效果.用转解毒酶基因工程菌喂有机磷中毒的鸡,表明该转解毒酶基因工程菌对有机磷中毒的鸡,无论是急性中毒还是慢性中毒都有较明显的解毒作用.

不同地区小菜蛾种群的抗药性及酯酶同工酶的研究

用淀粉凝胶电泳对中国 3个不同地理区域的小菜蛾种群和台湾敏感品系的抗性水平及酯酶同工酶进行了研究 ,结果发现 :生物测定显示 3个小菜蛾种群对杀虫双均没有明显的抗性 ;对阿维菌素的抗性分别为 1.2 1倍、4 .51倍和 1.2 5倍。在 Estα和 Estβ基因位点 ,北京种群中存在 11种同工酶 ,其中 4种为 α同工酶 ,7种 β同工酶 ;河北种群中存在 3种 α同工酶 ,5种 β同工酶 ;云南种群中存在 3种 α同工酶 ,3种 β同工酶。 3个种群酯酶基因多态性的产生可能是携带不同抗性酯酶基因的小菜蛾被动运输的结果 ;杀虫双对于能引起酯酶活性升高的杀虫药剂可能无交互抗性。

不同种群小菜蛾对4种杀虫药剂的抗性及抗性基因频率

用 FAO推荐的点滴法测定了日本、台湾、广州、东莞等地小菜蛾 (Plutella xy-lostella L .)的抗药性。测定结果表明 :日本、广州的小菜蛾对阿维菌素显示出抗药性 ,其抗性比率分别是 4 .85倍和 10 .2 7倍。杀虫药剂抗性基因型频率测定显示 ,广州、广东东莞和北京种群的最高 ,基因型频率分别为 4 1.2 5%、4 1.2 5%和 58.2 3%。研究验证了快速测定杀虫药剂抗性基因型频率的方法 ,并提出了根据不同种群小菜蛾抗性基因型频率所应采取的综合治理策略。

不同地域有机磷杀虫药剂抗性库蚊复合组酯酶B1扩增的研究

在库蚊Ｃｕｌｅｘｐｉｐｉｅｎｓ品系中，非专一性酯酶的过量产牛是对有机磷杀虫药剂抗性的普遍机理。酯酶基因位于紧密连锁的Ａ和Ｂ座位上。现已知所有酯酶Ｂ的过量产牛都是基因扩增的结果。为了确定不同国家库蚊品系的酯酶Ｂ１的过量产生是否都是相同ＤＮＡ单基因型扩增的结果，我们构建了酯酶Ｂ１结构基因扩增区的限制性内切酶酶切图谱，分析了限制性酶切片段长度多态性（ＲＦＬＰ）。研究发现不同地理位置的酯酶Ｂ１库蚊，如法属圭亚那、委内瑞拉、波多黎各岛、美国加利福尼亚和中国北京，都有着相同的单基因扩增，但在扩增水平上有较大的差异。我们认为无论在美洲或亚洲，凡是酯酶Ｂ１扩增的库蚊都为同一个起源，之后经迁移而传播到各地；同时发现酯酶Ｂ１扩增的库蚊与酯酶Ａ２－Ｂ２扩增的库蚊相比，其迁移有一定的局限性；并巨酯酶Ｂ１扩增的库蚊仅仅限于美国、加勒比和中国的一些地区，而酯酶Ａ２－Ｂ２扩增的库蚊则广泛地分布于美国、加勒比、亚洲、非洲、太平洋各岛及欧洲等地。

有机磷抗性致倦库蚊种群中酯酶基因扩增的定量分析

致倦库蚊Culexqinquefasciatus是丝虫病的主要传染媒介。通过生物测定、单个蚊虫酯酶α2和 β2基因拷贝数分析和酯酶 β基因序列比较 ,分析了抗性水平、抗性相关基因在种群中的分布及其基因拷贝数等的抗性分子特征。应用快速PCR仪(real timequantitativePCRs)直接检测库蚊中酯酶基因和mRNA拷贝数。结果显示 :上海致倦库蚊对对硫磷的抗性LC50 为8 12 ,酯酶活性升高是上海致倦库蚊种群对有机磷杀虫药剂产生抗性的主要机理。编码致倦库蚊酯酶 β的氨基酸序列同编码尖音库蚊酯酶B1的氨基酸序列相比同源性为 98% ;同致倦库蚊酯酶B2氨基酸序列相比同源性为 10 0 % ,同环蹶库蚊酯酶B3氨基酸序列相比同源性为 90 % ,上海致倦库蚊中酯酶α和 β基因均扩增。有机磷抗性的上海和PellRR蚊虫种群中单个蚊虫酯酶α2和β2定量基因拷贝数均不同 ,其同一蚊虫个体的酯酶α2比酯酶 β2基因的拷贝数高 ,但没有明显的规律性 ,酯酶结构基因的扩增是上海致倦库蚊种群对有机磷杀虫药剂抗性的主要机理 ,估计在野外种群的杂合个体中存在多种调控机制。

耐热蛋白质延长因子(EF-Tu)的分子和功能的性质(英文)

本文用亲和层析法从Calderobacteriumhydrogenophilum(极端耐热细菌)中分离得到纯的耐热蛋白质延长因子。测得其相对的分子量为51000。该蛋白质对热极其稳定,从膜过滤分析法测定EF-Tu 的活性可知,在80℃加热5 min后,原活性仅仅失去50%。Ouchterlony双向免疫扩散的结果表明,该蛋白延长因子与E.coli 延长因子有着抗原的相似性。而且该因子只含一个半胱氨酸残基,其位置在半胱氨酸81,即肽段T_(13)。Southern 杂交试验的结果显示出C.hydrogenophilum 的染色体DNA 中可能有两个基因编码同一蛋白。

昆虫基因工程研究进展

昆虫基因工程的目的是将外源基因或DNA片段引入昆虫细胞,使之发生转化,获得具有各种优良特性和抗性的新型昆虫。它的主要内容可以简单地归纳如下几个主要方面:①从种类繁多的昆虫基因群体中分离出有益的操作基因;②寻找或构成能够承受人们感兴趣的外源基因的插入和进行遗传等特性的克隆载体;③将重组的载体通过体外转化等方法导入昆虫受体细胞(卵)。

致倦库蚊主要组织结构的石蜡切片观察

【目的】蚊虫是传播人类多种疾病的重要媒介害虫,对其组织形态学的认识是开展众多领域研究的基础。本文通过研究致倦库蚊Culex pipiensquin quefasciatus成虫组织结构及形态,为媒介蚊虫的抗药性研究及有效防治提供基础材料。【方法】采用改进的石蜡切片法和HE染色,结合活体内脏器官解剖及光学显微镜观察,从形态学和组织学水平对致倦库蚊组织结构做详尽展示。【结果】获得结构完整、染色清晰、定位准确的消化排泄系统、生殖系统、神经系统、呼吸系统等HE染色石蜡切片。【结论】探讨了改进制片和染色过程中一些步骤及注意事项。研究结果为利用原位杂交、免疫组化等方法研究蚊虫体内抗药性基因的准确定位及基因功能分析提供了可靠的基础。

程序化设计简并引物与克隆小菜蛾酯酶基因

利用遗传密码简并性 ,针对特定的氨基酸序列设计简并引物 ,是克隆蛋白质家族cDNA的常规方法。文章介绍了利用blastp ,blockmaker,CodeHop ,SwissProt,SpTrEMBL等网络工具及数据库设计昆虫抗性酯酶的简并引物。用这对引物从抗有机磷杀虫剂的小菜蛾Plutellaxylostella中克隆了 1段cDNA。经blastx检索genebank,发现此cDNA产物与其它昆虫抗性酯酶基因有高度的相似性。研究表明 ,程序化设计的简并引物可信性强 ,阳性率高 。

解毒酶基因的克隆及在大肠杆菌中的融合表达

用ＲＴ－ＰＣＲ克隆了酯酶Ｂ１５’端Ｂ１（ａ），并对其进行了序列测定，将其与３’端Ｂ１（ｂ）一起连接到ｐＥＴ－２８ａ中，构建了完整融合表达载体ｐＥＴ－ＥＳＴＢ１。转化大肠杆菌ＢＬ２１，在ＩＰＴＧ诱导下，经过１２小时，酯酶Ｂ１在大肠杆菌内的融合表达达到２７％。通过纯化获得１条带的重组蛋白。用粗酶对马拉硫磷的降解显示，该解毒酶在１５分钟即降解２２．１％，具有较高降解有机磷酸酯类农药的能力。为利用真核生物的自然资源进行农药污染的生物治理等提供了新途径。

一个实用的群体遗传学分析软件包——GENEPOP3.1版

GENEPOP是一个非常实用的群体遗传学分析软件包 ,适用于对大量的群体遗传学数据进行分析。它主要有以下 3个方面的用途 :1)进行正合检验 ,如对哈迪_温伯格平衡、种群差异和位点间的连锁不平衡进行检验 ;2 )估算经典的群体遗传学参数 ,如Fst和其它相关指数及基因频率等 ;3)可把GENEPOP的输入文件转换为其它常用的群体遗传学分析软件包 (如BIOSYS、FSTAT和LINKDOS)所要求的输入文件格式。与软件BIOSYS相比 ,它在所用的统计学检验方法。

不同地理种群尖音库蚊复组抗性动态和遗传多样性

通过生物测定、蛋白质电泳和等位酶分析等方法对5个不同地区的尖音库蚊复组蚊虫Culex pipienscomplex的抗性水平、种群中非特异性酯酶基因表型分布和种群遗传多样性进行了研究。不同地理种群的抗性检测结果表明:5个种群分别对敌敌畏、对硫磷、氯菊酯和溴氰菊酯的抗性较高,对残杀威、巴沙和胺菊酯的抗性较低;朝阳种群对敌敌畏抗性最高(55.7倍),武汉种群次之;佛山种群对氯菊酯和溴氰菊酯的抗性比率高达123倍和23.9倍。酯酶电泳结果显示:5个种群间酯酶多态性存在差异,广州和佛山两个库蚊种群酯酶表型多态性最高,有B1,A2-B2,A8-B8,A9-B9,B10和A11-B11等6种酯酶表型,提示高活性酯酶是主要的抗性机制。群体遗传学研究表明:每位点平均等位基因数(A)为2.76,平均多态位点百分率(P)为64.45%,平均预期杂合度(He)为0.1943,种群间遗传分化系数(Fst)值为0.10,平均基因流(Nm)=2.57,说明5个种群有较丰富的遗传多样性,种群内遗传多样性高于种群之间。据此推测,种群间可以通过迁徙等方式进行基因交流,使得遗传结构、抗性水平朝一致性方向变化。本研究对我国尖音库蚊复组蚊虫的综合治理有一定指导意义。

cDNA末端快速扩增技术及其应用

cDNA末端快速扩增(RACE)技术是一种快速获得cDNA的3’和5’端的方法。从RACE的原理出发,指出其技术本身存在的优缺点,阐述了RACE操作中须注意和不容忽视的技术要点,并对前人对RACE技术所做的改进加以总结,最后对RACE技术的应用前景给予了展望。

水母雪莲Myb转录调控因子SmP基因的克隆及序列分析

采用TD PCR(TouchdownPCR)法从水母雪莲 (SaussureamedusaMaxim)红色系愈伤组织cDNA文库中筛选并克隆了雪莲Myb转录调控因子SmP (S .medusaMaximMyb relatedPgene)基因。序列分析表明该基因全长 96 9bp ,包括一个 771bp的完整开放阅读框架 (ORF) ,编码一个 2 5 6氨基酸残基的蛋白质。氨基酸序列的同源性分析表明在N 端具有两个典型的R2R3 MybDNA结合结构域。C 端富含亲水的丝氨酸S(18 38% ) ,且以寡聚体的形式存在 。

抗性库蚊酯酶基因在大肠杆菌中的克隆和表达

用抗性库蚊酯酶基因,引入原核表达载体pRL439,转化大肠杆菌HB101细胞,获得表达。通过酶切、Southern杂交鉴定重组质粒。研究了重组菌酯酶的活性,重组质粒pRLB1表达的酯酶具有高酶活并能高效降解酯酶的特异性底物α乙酸萘酯(αNA)和β乙酸萘酯(βNA);经对重组菌进行细胞固定化后降解农药三氯杀虫酯(7504),反应时间短。

一种工程菌的高酶活及其固定化细胞对农药的降解

将抗性尖音库蚊五带亚种的执有机磷农药基因—酯酶基因克隆到质粒pRL－439中．经检测，重组质粒中的酯酶基因已得到表达，获得高酶活的工程菌．将工程菌固定化后对两类难降解农药（有机氯、菊酯类）进行降解，结果表明，固定化细胞在1h内对上两类农药可降解90％以上，具有很高的降解效力．

不同地理种群小菜蛾的遗传多样性分析

采用水平切片淀粉凝胶电泳方法 ,分析了北京、河北、云南和武汉 4个不同地理种群的小菜蛾的等位酶 ,得到了 3个酶系统 (甘油醛磷酸脱氢酶 ( GPD)、苹果酸酶 ( ME)和苹果酸脱氢酶 ( MDH-1 ,MDH-2和 MDH-3) ) 5个基因位点的资料。用 Biosys2 .0软件计算了不同地理种群的遗传变异指标 ( N、A、P、Ho和 He) ,结果表明小菜蛾各种群内的基因多样性大于各种群间的基因多样性 (约 1 5倍 ) ,武汉种群小菜蛾的遗传多样性最大。并计算了遗传距离 D和相似性系数 ,并由此得出聚类图 。

杭州淡色库蚊抗性及酯酶活性测试

目的 :用淀粉电泳酯酶谱区别酯酶 ,检测淡色库蚊成蚊个体酯酶 ,并结合对幼虫的生物测试结果 ,探讨抗性生化机制及防制对策。方法 :幼虫的生物测试采用浸渍法 ,成虫的非特异性酯酶测试采用淀粉电泳法。结果 :淡色库蚊对氯氰菊酯抗性最高 ,是敏感品系的 12 .30倍 ;其后顺次为敌敌畏、高效氯氰、溴氰菊酯、残杀威、仲丁威 ,抗性倍数分别为 5 .6 1、5 .0 9、4.6 5、4.43、3.98,胺菊酯、二氯苯醚菊酯、EBT、三氯杀虫酯抗性不明显。淀粉电泳结果蚊虫个体中存在过量产生的非特异性酯酶Estβ11和Estα 2 /β2 ,且蚊虫的酯酶谱较为复杂。 结论 :淡色库蚊对氯氰菊酯产生了中等抗性 ;其次对敌敌畏、高效氯氰、溴氰菊酯产生低抗性 ,宜换用药物。酯酶染色结果 ,存在引起有机磷抗性增高活性酯酶 ,酯酶谱且呈多态分布 ,与生物测试结果相一致 ,所以应减少敌敌畏的使用 ,注意轮换用药。