芽孢杆菌嗜铁素研究进展

嗜铁素(Siderophore)是微生物为适应自然界高氧低铁环境,产生的一类能特异性螯合三价铁离子的小分子化合物。绝大多数细菌和真菌都能通过非核糖体肽合成酶途径(NRPS)或非依赖NRPS途径(NIS)合成一种或几种嗜铁素。芽孢杆菌是目前研究与生产上应用最多的一类生防细菌,但芽孢杆菌嗜铁素的生防贡献国内外鲜有报道。本文对芽孢杆菌嗜铁素的种类、合成与调控机制、功能与应用(包括竞争作用、抗生作用、毒力作用、环境污染修复作用以及在医药研发上的应用等)进行了系统概述,为解析自然界中芽孢杆菌具有广谱抗菌活性的生防机制提供理论依据,同时对研发嗜铁素和药物偶联的新型靶向农药具有重要指导意义。

4种喷雾助剂对解淀粉芽胞杆菌Lx-11的增效作用及安全性评价

为提高解淀粉芽胞杆菌Lx-11悬浮剂对水稻白叶枯病的防治效果,通过研究添加4种喷雾助剂(有机硅、TM-10、卵磷脂和SY-6535)对解淀粉芽胞杆菌Lx-11含菌量的影响、药液的表面张力和接触角的变化、助剂对水稻生长的安全性影响等,并测定了添加助剂生防菌对白叶枯病的盆栽防治效果以及在水稻叶表定殖动态,最终筛选出适合的喷雾助剂。结果表明:添加卵磷脂的解淀粉芽胞杆菌Lx-11悬浮剂的含菌量显著降低;添加有机硅、TM-10和SY-6535均能有效降低悬浮剂的表面张力及其在水稻叶片上的接触角。安全性评价显示,有机硅、TM-10和SY-6535对水稻幼苗生长无影响。盆栽试验结果表明,添加TM-10和SY-6535后,解淀粉芽胞杆菌Lx-11悬浮剂(4.0×109cfu/mL)对水稻白叶枯病的防治效果达到57.70%和56.56%,显著高于未添加助剂的悬浮剂的防治效果;定殖试验结果表明,添加助剂后,解淀粉芽胞杆菌Lx-11在水稻叶表的定殖量也显著高于对照处理。

贝莱斯芽胞杆菌YL2021高产嗜铁素的摇瓶发酵工艺优化

贝莱斯芽胞杆菌Bacillus velezensis YL2021是一株对多种植物病原菌具有良好防治效果的生防菌,其基因组中含有完整的儿茶酚型嗜铁素合成基因簇,在缺铁条件下能产生具有抑菌作用的嗜铁素。为了提高贝莱斯芽胞杆菌YL2021嗜铁素的产量,采用摇瓶培养发酵,通过Plackett-Burman(PB)试验、中心组合试验(central composite design,CCD)和响应曲面法(response surface methodology,RSM)分析,优化菌株YL2021高产嗜铁素的发酵培养基成分和培养条件。结果表明,菌株YL2021高产嗜铁素的最优培养基配方:葡萄糖19.43 g/L、NH_(4)Cl 1.93 g/L、KH_(2)PO_(4)9.02 g/L、谷氨酸钠6.00 g/L、Mg SO_(4)1.75 g/L和Ca Cl20.08 g/L;最优培养条件为:温度30℃、初始p H值7.0、接种量5%、培养时间36.5 h、转速200 r/min和装液量75 m L(250 m L三角瓶中)。菌株YL2021在优化条件下嗜铁素产量达到734.86μmol/L,较优化前提高了10.34倍,优化效果明显。本文结果表明,已成功建立了适用于YL2021高产嗜铁素的摇瓶发酵体系,为嗜铁素的生防应用提供理论基础和技术支撑。

枯草芽孢杆菌Bs916防治番茄青枯病

采用室内MS平板植物组培法、温室盆栽试验和微生物特异性平板分离检测技术,评估了枯草芽孢杆菌Bs916对番茄的促生、防治青枯病的作用,研究了菌株Bs916对番茄根表及茎内青枯菌种群数量的影响和对番茄根围可培养微生物含量的影响。在植物组培MS平板中,枯草芽孢杆菌Bs916对番茄植株鲜重具有促生作用,播种15 d后,其鲜重达79.8 mg,比未处理对照增加9.61%。盆栽试验显示,枯草芽孢杆菌Bs916灌根处理番茄后14 d,对番茄青枯病的防治效果达55.6%;菌株Bs916处理番茄后,番茄根表、茎内青枯菌含量和未处理对照的青枯菌含量变化趋势一致,均呈现随着时间的改变而逐渐下降的趋势,菌株Bs916处理的根表青枯菌含量约为未处理对照的1/100~1/10,而茎内青枯菌含量为未处理对照的1/50~1/2。此外,菌株Bs916的施用对番茄根围土壤中细菌种群具有先抑制后促进的作用,对真菌具有先促进后快速抑制的作用,而对根围放线菌则无显著性影响。以上结果表明,芽孢杆菌Bs916具有潜在的防治番茄青枯病的田间应用前景,也为其田间应用提供了理论基础。

集成生物防治和秸秆还田技术对设施番茄增产及土传病害防控效果研究

本研究在设施条件下，评估了综合使用秸秆还田和生防菌技术对设施番茄连作土传病害的防治效果及增产作用。研究表明：1）秸秆还田技术有利于温室内C02积累，比常规温室C02的含量普遍高200-400μL．L-1，同时能够提高地温0．5℃；2）分别单独使用2个生防菌、单独使用秸秆还田技术和2项技术集成使用的5个处理中，生防菌PTS394＋秸秆综合处理效果最好，株高和茎粗分别比常规增加达到35．9％和20．9％，理论产量达9302．7kg·667m^-2；3）土传病害防效调查显示，生防菌PTS394＋秸秆和B1619＋秸秆2个综合处理防效最好，分别为68．0％和66．2％。基于理论产量、市场番茄价格及投入成本情况，最终计算得出综合应用生防菌PTS394和秸秆还田技术处理的理论亩纯收益最高，为23071元，番茄效益增收达41．7％。本研究为生防菌和秸秆还田技术在田间的综合使用提供了理论基础。

枯草芽孢杆菌Bs916在番茄根部的定殖

为了明确生防枯草芽孢杆菌Bs916在番茄根部的定殖能力,本研究基于Bs916全基因组数据,分析了Bs916中参与生物膜形成的关键编码基因簇,研究了Bs916及其绿色荧光蛋白(GFP)标记菌株Bs916G抑制番茄青枯菌的能力和生物膜形成能力,并采用植物MS平板定殖研究法和温室盆栽试验评估了Bs916在番茄根部的定殖能力和规律。全基因组分析结果表明,枯草芽孢杆菌Bs916拥有完整的生物膜形成关键基因(簇),包括胞外多糖(EPS)合成酶编码基因簇、Tas A蛋白和γ-多聚谷氨酸聚合酶编码基因簇,其大小分别为15 715 bp、786 bp和4 369bp,与已报道的相关氨基酸序列同源性达96%~100%。室内试验显示,GFP标记菌株Bs916G具有和野生菌株相同的抑制番茄青枯菌的能力和生物膜形成能力。在MS平板试验中,Bs916在番茄根部的定殖量可达3.1×107CFU/g。盆栽试验结果显示,在常规土壤或接种青枯菌处理中,Bs916在番茄根部的定殖数量都呈现先下降后上升,最后趋于稳定的趋势。表明,枯草芽孢杆菌Bs916可以在番茄根部有效定殖,这为其在田间防治番茄青枯病提供重要保障。

枯草芽孢杆菌PTS-394诱导番茄对灰霉病的系统抗性

本文研究了枯草芽孢杆菌PTS-394对番茄的防御相关酶活性、抗病信号转导通路的标志基因表达的诱导情况和诱导抗病性对灰霉病的防治效果。结果显示,菌株PTS-394灌根番茄后,在24~72 h内番茄顶端叶片中PAL、PPO、POX、LOX的活性都有不同程度的持续增加,且72 h时达到最高峰值,随后在96 h下降,与对照相比差异显著;此外,番茄抗病信号通路节点基因NPR1和水杨酸(SA)信号通路激发的防卫基因PR-1a,在24~72 h得到了显著持续高表达。以上结果表明,利用菌株PTS-394灌根番茄后,能够诱导植株产生系统抗病性。菌株PTS-394灌根番茄后48 h,离体叶片挑战接种番茄灰霉菌,结果显示,菌株PTS-394处理的番茄叶片病斑面积仅为对照处理的50%,防控效果达47.1%;温室盆栽试验显示,菌株PTS-394处理后对番茄灰霉的防治效果为58.2%。综上所述,枯草芽孢杆菌PTS-394灌根番茄后,可以触发番茄植株系统性的抗病性,增强植株免疫能力。

枯草芽胞杆菌T-500产脂肽类抗生素的摇瓶发酵工艺优化

[目的]枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)T-500是1株对水稻纹枯病和稻瘟病均有良好防治效果的生防菌,通过优化其摇瓶发酵工艺,从而提高发酵液中脂肽类抗生素的含量,为T-500菌株生防制剂的开发提供技术支撑。[方法]以水稻纹枯病菌(Rhizoctonia solani)为指示菌,利用酸沉淀法提取T-500菌株发酵液中的脂肽类抗生素,并进行脂肽抗生素粗提液的抑菌效果分析,筛选影响抑菌效果的发酵培养基主成分;随后通过Plackett-Burman试验设计、中心组合试验设计和响应曲面法,优化T-500菌株高产脂肽类抗生素的发酵培养基成分和发酵条件。[结果]T-500菌株高产脂肽类抗生素的最佳培养基为:黄豆饼粉7.00 g·L^(-1),蛋白胨4.92 g·L^(-1),酵母粉1.90 g·L^(-1),小麦粉5.00 g·L^(-1),玉米糊5.00 g·L^(-1),NaCl 1.00 g·L^(-1),MgSO_40.20 g·L^(-1),MnSO_45.0 mg·L^(-1),FeSO_40.5 mg·L^(-1)。最佳发酵培养条件为:装液量500 mL三角瓶装105 mL,接种量0.87%,发酵时间41.35 h,温度28℃,转速180 r·min^(-1)。利用最佳摇瓶发酵工艺,T-500菌株所产生的脂肽类抗生素对纹枯病菌的抑菌带最宽,达(11.23±0.15)mm,菌含量达(7.41±1.18)×109CFU·mL^(-1)。经摇瓶发酵试验和抑菌活性验证,理论预测值与实际值无显著差异。质谱和色谱检测表明:优化发酵工艺后产生的Surfactin含量较基础培养基提高了48.2%,Iturin含量较基础培养基提高了180.9%;优化发酵工艺后检测到了Fengycin的产生,但优化前未发现Fengycin的产生。[结论]利用响应曲面法成功优化了枯草芽胞杆菌T-500产脂肽类抗生素的摇瓶发酵工艺;优化后,T-500产脂肽类抗生素产量增加,抑菌活性增强。

Bacillus subtilis PTS-394对番茄根系及根围微生态的影响

为了明确枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)PTS-394对番茄根系及根围微生态的影响,本研究采用生理生化方法测定了番茄根系活力和根围土壤酶活性,并测定了番茄根冠比及根系周围可培养微生物的数量。结果表明,枯草芽孢杆菌PTS-394能够显著促进番茄根系生长,促进生长率达25%;同时PTS-394还能够提高根系活力,在PTS-394处理后第12 h、24 h,根系活力均比对照显著增高,增高比例分别为17.0%和25.6%,随后根系活力和对照基本持平并保持一致。枯草芽孢杆菌PTS-394的施用对番茄根围土壤中的放线菌具有显著的促进作用,对真菌具有轻微的抑制作用,而对细菌则无明显作用。此外,PTS-394能够促进番茄根围土壤脲酶和土壤蔗糖酶的活性,但其对2种酶的作用均有时效性,其影响会随着时间的变化而逐渐减弱。

芽胞杆菌工程菌株B9BD产表面活性素发酵培养基优化

生物农药“纹曲宁”的主要活性成分—枯草芽胞杆菌Bacillus subtilis Bs916可产生多种脂肽类抗生素。前期研究发现,degU和bmyA基因的突变株B9ΔdegUΔbmyA(B9BD)可以高效合成表面活性素(Surfactin)。本研究通过对培养基主要成分的单因素筛选并利用Design expert软件优化了工程菌株B9BD高效发酵产生Surfactin的培养基组分。通过Plackett-Burman试验、中心组合试验(CCD)和响应曲面法(RSM)优化了发酵Surfactin的最优培养基配方:葡萄糖24.27 g/L,黄豆粉29.05 g/L,牛肉浸膏3 g/L,NH_(4)NO_(3)4 g/L,L-亮氨酸2.36 g/L,KH_(2)PO_(4)3 g/L,NaCl 3 g/L,FeSO_(4)0.02 g/L。在优化培养基中,B9BD产生Surfactin的量高达到(934.25±32.67)mg/L,是其在LB培养基产量的5.6倍。以上研究结果将为Surfactin的高效发酵和应用提供理论基础和技术支撑。

表达Harpin蛋白的芽孢杆菌工程菌的构建及其生防效果

利用同源重组方法将来源于水稻细菌性条斑病菌的Harpin(HpaG Xooc)编码基因hpa1分别插入根围拮抗解淀粉芽孢杆菌FZB42的蛋白水解酶编码基因aprE和nprE位点,成功构建双拷贝Harpin表达工程菌株FZBHarpin。反转录PCR检测结果显示,hpa1能在RNA水平上正常转录表达。工程菌FZBHarpin发酵72 h后,其发酵液可引起烟草过敏性反应,这表明Harpin蛋白外泌胞外并保持生物活性。利用FZBHarpin浸种烟草后,烟草主根长达64.05 mm,比对照增加了30%,促生效果是FZB42的2倍。盆栽水稻白叶枯病防治试验结果显示,FZBHarpin防效为51.9%,比出发菌株FZB42防效显著提高。这为利用病原物中可激发植物产生抗病性的激发子来遗传改良生防微生物提供了理论基础。

枯草芽胞杆菌PTS-394可湿性粉剂对辣椒根系及根际微生态影响

本研究通过测定辣椒根系活力及生长情况,检测根际土壤可培养微生物数量和土壤酶活性等,以期明确枯草芽胞杆菌PTS-394可湿性粉剂对辣椒根系及根际微生态的影响。结果显示,枯草芽胞杆菌PTS-394可湿性粉剂(1:100)稀释菌液能够显著促进辣椒根系的伸长,促生比例达8.61%,对辣椒根重量也有促进作用,增加比例为19.2%,同时还可以显著提高辣椒的根系活力,尤其是在施用后的第12和24 h;而菌株PTS-394(1:1000)稀释菌液虽然对辣椒的根长、重量和根系活力也都有促进作用,但未达到显著效果。此外,稀释100倍的枯草芽胞杆菌PTS-394可湿性粉剂对辣椒根际土壤中的真菌和放线菌含量均具有显著抑制作用,最高抑制率分别达63.6%和69.5%,而对细菌则无显著影响。同时,该稀释浓度的PTS-394菌液还具有促进土壤脲酶和蔗糖酶活性的作用。本研究结果不仅扩展了枯草芽胞杆菌PTS-394可湿性粉剂的施用范围,丰富了促生机理,更为其在设施辣椒栽培中的安全使用提供了理论基础。

江苏省淮安市设施辣椒病虫害的发生及防治现状调研分析

为明确江苏省辣椒主栽区淮安市设施辣椒病虫害的发生及防治情况,于2016年对淮安市淮阴区10个辣椒种植村庄的50位种植户(约22 hm^2)进行设施辣椒主要病虫害发生及防治现状的走访和现场问卷调查。结果表明,设施辣椒栽培过程中发生的主要病害有死棵、灰霉病、疑似猝倒病(立枯症状)和顶叶黄化脱落的病毒病,对病害的防治主要采用打保险药(混合多种药剂预防)和看到症状再打的策略;发生的主要虫害有青虫、蚜虫、烟粉虱,螨虫和蜗牛也偶有发生,对害虫采取见虫就打的防治策略。农户使用药剂防治的频次主要集中于6~10次/茬(51.02%)和11~15次/茬(46.94%),用药间隔时间主要集中在7~10 d/次(75.51%),用药成本在100~300元之间的农户占比为71.43%。2017年,通过对调查地辣椒田间发病病株的症状诊断和疑似病原菌的分离鉴定,最终确定引起辣椒死棵、萎蔫、顶叶发黄脱落等症状的病原菌,明确病害种类,其中引起设施辣椒定植培土后发生死棵的主要是立枯病,引起辣椒中后期青枯萎蔫的主要是根腐病(由疫霉或镰刀菌引起),而导致顶叶发黄脱落的主要是病毒病,引起辣椒分枝褐变、叶片枯萎的主要是菌核病。通过调查研究,可以初步明确近年来淮安市设施辣椒主要病虫害的发生特点,为当地蔬菜植保部门指导辣椒生产过程中病虫害的预测和防治提供参考。

西藏低温适生芽孢杆菌的分离鉴定及其抗菌和促生作用

从西藏拉萨色拉寺杂草根围土壤中分离到1株低温适生芽孢杆菌LSSC3,对该菌株进行了形态学、生理生化和分子生物学鉴定及抗菌和促生作用研究。菌株LSSC3细胞短杆状,芽孢圆形,10℃条件下生长良好。生理生化特征显示,该菌株与巨大芽孢杆菌Bacillus megaterium特征一致,但ERIC-PCR指纹图谱分析表明其与B. megaterium模式菌株存在显著差异。16SrRNA基因序列分析结果显示,菌株LSSC3与B. subtilis和B. atrophaeus的系统发育相似性均很高。进一步通过gyrB基因测序和比对,其同源性与B. atrophaeus达到100%,没有找到与B. subtilis的同源性关系。据此,将其鉴定为B. atrophaeus。菌株LSSC3对植物病原真菌和细菌均具有很强的抑制作用,同时对拟南芥有良好的促生长作用。该菌具有耐低温和生防的双重特点,具有在农业生产上应用的潜力。

利用芽孢杆菌生防菌防控土传病害引起的设施蔬菜连作障碍

使用生物防治技术控制土传病害,可以修复连作障碍,减少使用化学农药。通过田间试验表明,芽孢杆菌生防菌B-1619、PTS-394不仅可有效控制设施蔬菜土传病害引起的连作障碍,而且对植株有促生作用。

解淀粉芽胞杆菌Lx-11生物发酵工艺优化

对前期筛选获得和在田间试验中防治水稻细菌性条斑病效果较好的解淀粉芽胞杆菌Bacillusamyloliquefaciens Lx-11,通过Plackett-Burman试验设计及Box-Behnken设计的响应曲面法(response surfacemethodology,RSM)对影响生防菌株Lx-11发酵培养基和培养条件进行了优化。培养基3个主要因子的质量浓度分别为玉米淀粉11.2 g.L 1、黄豆粉14.6 g.L 1和酵母膏0.62 g.L 1。培养条件优化试验得出:培养温度、通气量和接种量是影响发酵活菌数的主要因子,由所得响应曲面方程预测出这3个主要因子分别为30.84°C、59.68 mL/250 mL和1.52%时,在初始pH为7.0,150 r.min 1培养48 h的条件下,发酵活菌数和抑菌带宽的最大值分别为3.75×109cfu.mL 1和8.2 mm。经摇瓶发酵试验和抑菌活性验证该理论预测值与实际值无显著差异。

利用转座子TnYLB-1构建枯草芽孢杆菌的突变体文库

为了鉴定枯草芽孢杆菌定殖和促进植物生长相关基因,用携带转座子TnYLB-1的穿梭载体pMarA转化枯草芽孢杆菌OKB105菌株。高温诱变条件下,筛选了2 000个转座子插入突变的单克隆,构建了OKB105菌株的突变体文库。对随机挑选的15个突变体采用PCR及Southern杂交验证,结果表明:转座子TnYLB-1以单拷贝、随机方式插入到OKB105菌株的染色体上。

生防菌PTS-394发酵培养基及培养条件的优化

生防菌PTS-394是前期筛选获得的一株对番茄青枯病有较好田间防效的枯草芽孢杆菌。通过Plackett-Burman试验设计及Box-Behnken设计的响应曲面法(RSM)对影响该菌发酵的培养基及培养条件进行优化,以提高PTS-394发酵量,增强其生防效果。结果表明:获得了PTS-394发酵达最大孢菌含量和抑菌活性时培养基关键因子的最优配比,此时菌含量和抑菌带宽的预测值分别为4.43×109 cfu·mL-1和6.20mm,与初始培养基相比,分别提高104.7%和44.8%,以优化的培养基为基础,得到了最优培养条件,此时发酵活菌数和抑菌带宽的最大预测值为6.32×109 cfu·mL-1和8.24mm,与初始发酵条件下相比分别提高39.2%和46.0%;且结果均得到了1L摇瓶发酵实测验证。结果证明所建模型对PTS-394发酵工艺的模拟是有效的,说明生防菌PTS-394发酵工艺可应用响应曲面法进行有效的优化。

番茄土传病害拮抗菌的筛选、评价及鉴定

为筛选出对其有较好防治效果的生防菌,本文以番茄青枯病菌(Ralstonia solanacearum)和番茄枯萎病菌(Fusarium oxysporum)为靶标菌,利用梯度稀释涂板法和平板对峙生长法从土样中分离、筛选出对2种病原菌分别具有较强抑制作用的拮抗细菌;并对其抑菌谱及代谢分泌物进行测定,运用Neighbor-Joining方法构建系统发育树,对拮抗细菌进行种属鉴定。结果表明,从60份土样中分离出对番茄青枯病菌有拮抗作用的细菌59株,其中抑菌圈直径>25 mm的有10株;对番茄枯萎病菌有拮抗作用的细菌30株,其中抑制率>30%的有4株。上述拮抗作用较好的14株拮抗菌,抑菌谱测定结果显示:N23-2、N58-2、NF59-3、NF61-1对多种病原细菌和病原真菌皆具有较好的拮抗作用;代谢分泌物检测结果显示:产纤维素酶的菌株有12株,产蛋白酶的菌株有11株,产嗜铁素的菌株有6株。种属鉴定结果表明:上述14株菌株中,有4株属多粘芽孢杆菌(Paenibacillus),3株属链霉菌(Streptomyces),3株属假单胞菌(Pseudomonas),4株属芽孢杆菌(Bacillus)。

甘蓝根肿病生防细菌的筛选、鉴定及评价

近年来,由芸薹根肿菌(Plasmodiophora brassicae Woronin)引起的十字花科蔬菜根肿病发生严重,筛选生防菌并研究其对甘蓝根肿病的控制作用,为其生物防治应用提供科学依据。采用平板对峙生长法筛选拮抗细菌并进行拮抗细菌抑菌谱的测定,常规PCR方法扩增拮抗细菌16S rDNA序列,应用BLAST进行同源性搜索,送至中国科学院微生物研究所进行拮抗细菌的种属鉴定,用地衣红染色法测定拮抗细菌对根肿病菌休眠孢子萌发的抑制作用,盆栽试验测定生防菌对甘蓝根肿病的防治效果。结果表明:多黏芽胞杆菌N3-4和枯草芽胞杆菌PTS-394具有较好的抑菌谱,对多种病原真菌和病原细菌的生长有较强的抑制作用;对甘蓝根肿病菌休眠孢子萌发的抑制率分别为60.84%和53.78%。不同地区病土和不同甘蓝品种的盆钵条件下,多黏芽胞杆菌N3-4和枯草芽胞杆菌PTS-394防控根肿病效果不同,最高防效分别达71.09%和65.62%。表明,多黏芽胞杆菌N3-4和枯草芽胞杆菌PTS-394是2株对甘蓝根肿病有较好应用前景的生防菌。