不同时间采集的小牛血清对CHO-C_(28)细胞培养及表达的影响

通过研究小牛血清对CHO-C28细胞培养及HBsAg表达的影响,探讨小牛血清的不同采集时间对血清质量的影响。采集出生后4、8、12h(未进食)小牛的血清,对CHO-C28细胞进行传代、换液培养,并检测乙肝表面抗原(HBsAg)表达量。结果可见:①在细胞传代4次时,4h采集的血清细胞生长状态良好,8h采集的血清细胞出现明显的衰老,12h采集的血清细胞大面积死亡;②在细胞维持换液方面,4h采集的血清可维持细胞换液25次以上,8h采集的血清可勉强维持20次,12h采集的血清维持细胞换液10次时已大部分死亡;③乙肝表面抗原(HBsAg)表达量的检测结果,同批培养上清,4h采集的血清培养细胞表达量最高。可见,小牛出生后采集血清时间越早越好。

在CHO-C28细胞大规模培养中提高收获次数及HBsAg的表达

目的 :在CHO -C2 8细胞大规模培养过程中增加收获次数 ,延长细胞收获周期 ,提高HBsAg收获量。方法 :采用 15L转瓶培养CHO -C2 8细胞 ,分 3组 ,对比观察不同小牛血清含量及pH值对细胞生长及HBsAg表达的影响 ,优化最佳培养条件。结果 :三组比较 ,实验 1组的收获次数最多 ,达 2 5次以上 ,HBsAg的表达量最高 ,收液量最多。结论 :优化了CHO -C2 8细胞的培养条件。

含preS2免疫表位的HBsAg基因质粒的构建及表达

目的 :应用表位设计构建高效表达乙型肝炎表面抗原含preS2免疫表位基因的真核表达质粒。方法 :PCR法从慢性乙型肝炎患者血清中扩增和分离preS2 12 0 - 146表位和S基因片段 ,将两者融合并置于载体pcDNA3 1的巨细胞病 (CMV)启动子作用之下 ,构建真核表达质粒pcDNA -S2S。序列分析和脂质体转染COS - 7细胞瞬时表达鉴定。结果 :序列测定结果表明插入序列与乙型肝炎病毒中国株全基因参照序列 (adr亚型 )一致。COS - 7细胞瞬时表达鉴定实验中 ,ELISA检测到preS2 -Ag和HBsAg的OD450 分别为 0 4 6 9和 0 4 2 6。结论 :应用表位设计成功地构建了含preS2免疫表位基因的重组质粒pcDNA -S2S所构建质粒能高效表达和分泌目的的蛋白。

青紫蓝兔棒状杆菌病的诊断与治疗

从发病情况、临床症状、病理剖检、实验室检查等方面对临床发生的青紫蓝兔棒状杆菌病例进行综合诊断。采用氨苄青霉素和庆大霉素对体表淋巴结化脓且已破溃的患兔进行治疗,并对比2种药物的治疗效果。结果表明,氨苄青霉素对青紫蓝兔棒状杆菌感染的治疗效果更优。

HEV ORF2截短融合蛋白的原核表达及其免疫原性

目的原核表达3型戊型肝炎病毒(hepatitis E virus,HEV)第2个开放阅读框(open reading frame 2,ORF2)截短融合蛋白(HEV3-179-Fe),并检测其免疫原性。方法分别扩增HEV3-179和Fe蛋白基因片段,经Overlap PCR法连接并扩增,克隆至载体pET-28a,构建重组表达质粒pET-28a-HEV179-Fe,将其转化感受态E.coli BL21(DE3),取阳性菌株,IPTG诱导表达融合蛋白HEV3-179-Fe,进行10%SDS-PAGE分析。目的蛋白经镍离子金属鳌合亲和层析纯化后,加入硫酸铵进行病毒样颗粒(virus-like particles,VLPs)重构,置电镜下观察。HEV3-179-Fe蛋白VLPs与氢氧化铝佐剂吸附后免疫小鼠,ELISA法测定效价,以评价HEV ORF2截短融合蛋白的免疫原性。结果重组表达质粒pET-28a-HEV3-179-Fe构建正确。目的蛋白HEV3-179-Fe相对分子质量约40000,主要以包涵体形式存在,表达量均达35%以上,纯度约95%,可与鼠抗HEV 3多抗发生特异性反应。硫酸铵重构后于电镜下可见直径约20 nm的VLPs,其免疫小鼠的血清效价达1∶4800000以上。结论原核表达了HEV3-179-Fe,且在小鼠体内具有较好的免疫原性。本实验为以HEV ORF2-179蛋白为基础的VLPs基因工程疫苗的研发奠定了基础。

一种铜锌超氧化物歧化酶突变体的原核表达、纯化及酶活性测定

目的原核表达、纯化一种铜锌超氧化物歧化酶(Cu,Zn-SOD)突变体,并检测其酶活性。方法将经热力学优化的Cu,Zn-SOD突变体基因亚克隆至pET-28a载体中,构建重组表达质粒SOD1-pET-28a,转化入大肠埃希菌BL21(DE3)中,IPTG诱导表达;在500 mL摇瓶培养条件下,通过改变加入Cu、Zn离子的量优化诱导表达条件;表达的重组蛋白经初步纯化后,测定酶活性。结果重组表达质粒SOD-pET-28a经双酶切及测序证明构建正确;表达的重组蛋白相对分子质量约为15000,主要以可溶性形式表达;工程菌株在500 mL摇瓶培养条件下培养至10 h左右,A600至3.5左右时加入终浓度为0.1 mmol/L IPTG、0.2 mmol/L ZnCl2、0.5 mmol/L CuSO4,可获得最佳表达量(29.2%);初步纯化获得的重组蛋白纯度为97.32%,比活为5.08×103U/mg。结论成功利用大肠埃希菌表达系统表达了一种经热力学优化的Cu,Zn-SOD突变体,初步纯化的突变体具有较好的酶活性,为进一步摸索大规模生产工艺及实际应用奠定了基础。