固定化超氧化物歧化酶的制备

目的 研究固定化超氧化物歧化酶(SOD)的制备方法。方法 分别以不同方法对铜锌超氧化物歧化酶(CuZnSOD)进行固定并比较其活力,对固定化方法进行相应的考察和优化。结果 以壳聚糖为载体,戊二醛交联法制备固定化SOD酶,酶活力和酶活回收率均较理想,固定化过程中的pH在6.0-8.2范围内,对固定化效果无明显影响;优化条件下制备的固定化铜锌超氧化物歧化酶,所得壳聚糖酶粉活力可达141 U·g-1,酶活回收率大于60％。结论 壳聚糖-戊二醛交联法可用于固定化超氧化物歧化酶粉的制备。

血清氧化-还原态的监测及其与细胞损伤的关系

目的 :探讨如何评价体内的氧化还原状态及细胞的氧化还原态改变对细胞增殖、凋亡、损伤等的影响。方法 :测定正常人血清的NADPH/NADP+ 和GSH/GSSG比值 ,以了解该两项指标对机体氧化还原态的监测能力。并在培养的内皮细胞中加入各种浓度的氧化剂过氧化氢 (H2 O2 )和 /或还原剂N 乙酰 L 半胱氨酸(NAC) ,观察NADPH/NADP+ 和GSH/GSSG比值的变化与细胞活力及损伤之间的关系。以LDH释放率 ,细胞培养液中脂质过氧化物 (LPO)的浓度 ,细胞增殖活性、细胞凋亡率 ,观察细胞的增殖、损伤及其与氧化 还原态变化的关系。结果 :①在培养的内皮细胞中加入H2 O2 后 ,GSH/GSSG和NADPH/NADP+ 比值明显降低 ,细胞氧化还原状态偏向氧化应激方向 ,细胞出现氧化应激损伤 ;脂质过氧化物 (LPO)生成增多 ;LDH释放率增加 ;细胞增殖活力下降 ;凋亡率增高。氧化应激性损伤程度与GSH/GSSG和NADPH/NADP+ 比值呈负相关 ( p <0 .0 5 )。②在各浓度H2 O2 组中加入 0 .5mmol·L 1NAC ,GSH/GSSG和NADPH/NADP+ 比值恢复至接近对照组 ,上述氧化应激性损害也受到了不同程度的抑制 ,并在一定范围内呈量效关系。③单独加入NAC ,在高浓度NAC1mmol·L 1M和 2mmol·L 1时 ,GSH/GSSG和NADPH/NADP+ 比值明显升高 (VSControl,p <0 .0 1 ) 。

血浆中游离还原型及氧化型谷胱甘肽的荧光测定法

文章建立了快速、可同时检测血浆中游离的还原型和氧化型谷胱甘肽(即GSH和GSSG)的方法,并评价了血浆中GSH/GSSG的氧化还原状态。利用二硫苏糖醇将GSSG还原成两分子的GSH,使GSH在pH8.0时与邻苯二甲醛(OPA)结合生成荧光产物GSH-OPA,用荧光分光光度仪测定其荧光值,从而对GSH和GSSG进行定量分析。并运用此方法测量青年健康志愿者静脉血中的游离GSH和GSSG。该法最低可检测出测定管中11.4 pmol.L-1GSH以及5.7 pmol.L-1GSSG。测量GSH批内和批间变异系数分别4.6%和3.9%,GSSG批内和批间变异系数分别为3.5%和4.1%,GSH,GSSG加标准品后的回收率分别为(99.77±5.70)%和(99.28±4.73)%。测定健康青年志愿者血浆中游离GSH,GSSG的含量分别为(16.5±2.4)nmol.mL-1和(1.7±0.35)nmol.mL-1。

甘草酸表面修饰万乃洛韦白蛋白纳米粒的制备及其肝靶向性研究

以万乃洛韦为模型药物 ,去溶剂化法制备普通载药纳米粒 ,结合高碘酸盐氧化法制备甘草酸 -万乃洛韦白蛋白纳米粒偶联物。对其表面甘草酸密度、形态、大小及其分布、体外释药特性、载药量、包封率、动物体内肝分布和体外肝细胞的摄取情况进行了研究。修饰纳米粒表面甘草酸密度为 9;平均粒径 d0 .5=2 6 8± 2 3nm;载药量1.35 % ;包封率 6 8.76 % ;体外释药符合双相动力学规律 ;对肝细胞具有选择靶向性。静注 15 min后 ,有 6 9.89%集中在肝脏 ,对照组为 6 4 .82 % ,二者之间存在显著差异 (P<0 .10 )。甘草酸表面修饰白蛋白纳米粒制备成功 ,为肝细胞靶向给药提供了新途径。

叶酸偶联白蛋白纳米粒肿瘤细胞靶向性研究

目的 研究能通过叶酸受体介导靶向肿瘤细胞的叶酸偶联白蛋白纳米粒。方法 利用叶酸活性酯在碱性条件下与白蛋白纳米粒表面上的氨基反应 ,制得叶酸偶联的白蛋白纳米粒。以荧光定量法确定浓度、时间、游离叶酸对肿瘤细胞摄取叶酸偶联白蛋白纳米粒的影响程度。结果 成功制备了叶酸偶联白蛋白纳米粒。叶酸偶联白蛋白纳米粒的肿瘤细胞摄取量随纳米粒浓度增大、培养时间延长而增加 ,肿瘤细胞对叶酸偶联白蛋白纳米粒的摄取可被过量的外源性游离叶酸所抑制。结论 叶酸偶联白蛋白纳米粒能通过细胞膜上的叶酸受体介导内吞入胞 。

异硫氰酸荧光素标记人血清白蛋白

目的 :用异硫氰酸荧光素 (FITC)对人血清白蛋白 (HSA)进行荧光标记。方法 :采用直接标记法 ,并考查不同投料比时的荧光素分子与蛋白分子的结合情况、荧光标记物 (FITC HSA)的荧光光谱及荧光寿命情况。结果 :FITC HSA的激发波长为 5 0 0nm ,荧光波长为 5 30nm ;其固态和液态低温保存时荧光寿命分别为一年和

Hochest染料-荧光分光光度法测定基因治疗非病毒载体中DNA的含量

目的 利用荧光染料Hoechst 332 5 8与DNA结合后 ,荧光强度显著增强的特点 ,建立了基因治疗非病毒载体中DNA的含量测定方法。方法 对Hoechst 332 5 8-DNA溶液进行荧光扫描 ,并建立了标准曲线。分别测定了纳米粒胶体溶液超速冷冻离心后的上清液和用酶消化后的脂质体提取液中DNA的含量。结果 Hoechst332 5 8-DNA溶液的最佳激发波长为 35 3.6nm ,最佳发射波长为 4 5 4 .4nm ,标准曲线的线性范围为 0 .2～ 1.0 μg·ml-1。测得包载DNA纳米粒的平均包封率为 75 .1%± 8.6 %(n =5 ) ,DNA阳离子脂质体的平均抗核酸酶能力为 84 .9%± 7.8% (n =5 )。结论 荧光染料Hoechst332 5 8可用于测定基因治疗非病毒载体中DNA的含量 ,所建立的荧光分光光度法为载基因纳米粒、脂质体制备工艺和质量标准的建立提供了依据。

GFP质粒DNA/阳离子脂质体复合物的制备及其体外表达

目的 为基因免疫和基因治疗寻找一种简单、经济、有效的 DNA投递系统。方法 采用逆向蒸发法 ,用卵磷脂、胆固醇、十八胺制备成阳离子脂质体包封含绿色荧光蛋白基因的真核表达质粒 p EGFPC1,对三种不同DNA加入量所形成的 DNA/脂质体复合物的微球形、包封率、电荷性、转染真核细胞的效果以及对细胞的毒性作用进行初步检测研究。结果 所获得的 DNA/脂质体复合物呈球形、平均粒径为 5 6 2 nm;包封率达 5 5 %～ 6 5 % ,为阳离子脂质体 ;都能有效转染真核细胞 ,但转染效率有差异 ,DNA/脂质体混悬液中 DNA含量、混悬液的加入量以及细胞的作用时间 ,都对细胞毒性有不同程度的影响。结论 该方法可作为提高基因免疫效果的简单、经济。

测定人血清白蛋白的荧光光纤流动免疫分析系统

用新型荧光光纤免疫传感流动分析测试系统 ,对人血清白蛋白 (HSA)进行测试 ;将偶联于微晶纤维素表面形成的HSA固相抗体与待测HSA(抗原 )、荧光标记抗原 (FITC_HSA)竞争性结合 ,经稀碱液处理 ,固相载体与抗原抗体复合物分离 ,用新型荧光光纤免疫传感流动分析系统测定解析液的荧光值 ,以求得待测HSA的含量 ;该法检出限为0.1g/L ,日内RSD0.91 %～6.4 % ,日间RSD1.8 %～8.0 %,加标回收率91 %～120 % ;用该法测定注射用HSA,与临床检验常用的溴甲酚绿法对照,具有良好的相关性 (r=0.9808)。

BSO对内皮细胞氧化还原状态的影响

目的 探讨人脐静脉血管内皮细胞(humanumbilicalveinendothelialcells, HUVEC)在慢性髓性白血病细胞株K562细胞条件培养基作用下氧化还原状态的变化与其增殖活性间的关系,观察谷胱甘肽合成抑制剂丁胱亚磺酰亚胺(buthioninesulfoxine, BSO)在上述条件下对HUVECs的作用,为探索相应的抗肿瘤血管生成治疗策略提供新思路。方法 用K562细胞条件培养基、谷胱甘肽合成抑制剂共同或单独处理HUVEC,检测HUVEC细胞内氧化还原状态以及细胞活力的改变。结果 K562细胞条件培养基明显促进内皮细胞的增殖,并促进内皮细胞氧化型与还原型谷胱甘肽(GSSG与GSH)、辅酶Ⅱ(NADP+与NADPH)两对氧化和还原性物质同时增高,但GSSG/GSH、NADP+ /NADPH比值未变。BSO显示出对HUVEC生长的明显抑制,引起HUVEC中GSH、NADPH含量明显降低、GSSG/GSH、NADP+ /NADPH比值升高;在K562细胞条件培养基的同时作用下,BSO对HUVEC的生长抑制作用增强, 使细胞内GSSG/GSH、NADP+ /NADPH比值进一步提高。结论 慢性髓性白血病细胞条件培养基使得血管内皮细胞对BSO的生长抑制作用更加敏感,其机制与内皮细胞氧化还原状态的改变密切相关。

恶性肿瘤组织的氧化还原态及其抗氧化能力的改变

目的探讨恶性肿瘤组织的氧化-还原态及其抗氧化能力的改变。方法42例原发性消化道恶性肿瘤(食管癌13例、胃癌14例及结直肠癌15例),以其相对应的癌旁正常粘膜组织为对照,测定其谷胱甘肽氧化还原对(GSH、GSSG)的含量及辅酶Ⅱ氧化还原对(NADPH、NADP+)的含量,并据此计算出GSH/GSSG、NADPH/NADP+比值以及GSH/GSSG氧化还原电位值、NADPH/NADP+氧化还原电位值。结果癌组织中的GSH、NADPH含量明显高于癌旁组织(P<0.01)。GSH/GSSG、NADPH/NADP+的氧化-还原电位轻度还原偏移(P<0.05)。而GSSG含量及NADP+含量则与对照组无明显差异(P>0.05)。结论消化道恶性肿瘤组织的GSH、NADPH含量明显升高,提示其抗氧化能力明显增强;而在此基础上,其氧化-还原电位仅较癌旁组织轻度偏向还原方向,提示癌组织内仍存有较明显的氧化应激态。

SOD酶生物传感器筛选清除超氧阴离子自由基的活性物

目的 制备超氧化物歧化酶传感器 ,建立清除氧自由基药物的体外筛选方法。方法 将固定化铜锌超氧化物歧化酶与光纤氧传感器通过特定装置组装为酶传感器。以邻苯三酚的自氧化作为超氧阴离子的发生源 ,预置的固定化酶响应为内标 ,以已知有氧自由基清除作用的VitC为阳性对照 ,验证测定方法 ;通过对比加入样品前后邻苯三酚自氧化速度的变化情况考察样品清除超氧阴离子自由基能力。结果 酶传感器检测限为 7 0U ,使用寿命大于 2周。以本传感器对 1 5种样品进行了体外清除氧自由基活性实验 ,分别验证和发现了部分样品的清除活性。结论 所研制的传感器信号稳定性较好 ,测定方法简便、快速 ,能直观地获得氧自由基清除的动力学信息 。

抗HSA与微晶纤维素的固定化

采用溴化氰化学修饰法制备抗HSA -微晶纤维素固相抗体 .对制备条件进行了优化 ,以修饰温度 2 0℃、抗体浓度 3.5mg/mL为固定化最佳条件 ;并对固相抗体进行了扫描电镜测定。

用Fura-2测定人外周血中性粒细胞内游离钙浓度

本文用 2 - [6-双乙酸基 - 5 - ( 2 -双乙酸基 ) - 5 -甲苯氧乙氧基 ]- 2 -苯骈呋喃基 - 5 -恶唑羧酸五钾盐 ( Fura- 2 )建立了测定人外周血中性粒细胞内游离钙浓度的方法 ,并对一些测试条件进行了探讨。测定标本内中性粒细胞数以大约 10 6个 /m L为宜 ,在离心分离出中性粒细胞悬液时 ,标本制备好需静置 0 .5 h后才能上机测试 ,否则振荡形成的剪切应力将增大细胞内游离钙的浓度 ,p H偏离 7.4和受损细胞会极大增加细胞内游离钙的浓度。结果表明 ,正常人外周血中性粒细胞游离钙浓度为 3.95± 0 .76μg/L。对中性粒细胞内游离钙的测定有助于了解其功能状态。

成都地区青年人群中血浆和红细胞还原/氧化型谷胱甘肽的含量及其氧化-还原电位的分布

目的 :测量谷胱甘肽还原型和氧化型在血浆内和红细胞内的含量 ,探讨GSH/GSSG及其氧化还原电位在健康人群的分布情况。方法 :在组织内谷胱甘肽荧光测量法的基础上 ,加以改进 ,对血浆和红细胞内的GSH/GSSG进行测定 ,并计算出GSH/GSSH的氧化还原电位。同时 ,探讨了冷冻保存和去蛋白处理对血浆和红细胞内GSH和GSSG的影响。结果 :改进后的方法具重复性好 ;准确性高 ,回收率在 98.7%和 97.5 % ;标准曲线呈明显线性等良好的测定效率。用本法对 42名年青年健康志愿者的新鲜血浆和红细胞液的谷胱甘肽进行测定 ,结果为 :血浆内GSH的范围为 8.64± 1 .40 μmol/L ,GSSG的范围为 1 .0 8± 0 .2 4μmol/L ,GSH/GSSG的比值为1 0 .2 7± 1 .5 4;红细胞内GSH的范围为 6.81± 1 .3 8μmol/LRBC ,红细胞内GSSG的范围为 0 .77± 0 .3 9μmol/LR BC ,GSH/GSSG的比值为 9.0 2± 3 .61。血浆GSH/GSSG的氧化还原电位为Eh =-2 1 3 .9mV± 4.94mV ;RBC液的Eh =-2 2 1 .4mV± 3 .1 6mV ,血浆内和红细胞内的GSH/GSSG比值以及电位值都呈正态分布。血浆和红细胞在 -80℃条件下保存后对GSH和GSSG的测定有一定影响 (p <0 .0 5 )。结论 :本文建立的GSH/GSSG测定方法具有良好的重复性、准确性 ;

酪氨酸与CGE（N）的反应及其在荧光检测中的应用

本实验建立了以自制新荧光剂ＣＥＧ（Ｎ）为衍生化试剂测定氨基药物（或化合物）的方法。以酪氨酸为试验化合物与ＣＧＥ（Ｎ）在碱性条件下发生反应。产品经四谱及元素分析证明与预期结构一致。又借助此反应，用薄层荧光扫描法检测酪氨酸，测定结果：酪氨酸－ＣＧＥ（Ｎ）的ＥＸ＝２７７ｎｍ，ＥＭ＝３６６ｎｍ；定量线性范围在０．５～１５μｇ，检测限０．５μｇ（以酪氨酸计），线性回归相关系数在０．９９以上，稳定时间为２５小时。结果表明了新型荧光剂的可用性及方法的可靠性。

流体切应力对中性粒细胞内Ca^(2+)的影响

流体切应力是中性粒细胞的重要功能环境 ,但以往的研究很少涉及力学作用对中性粒细胞的影响。我们利用旋转粘度仪提供的流体切应力作用于分离的中性粒细胞 ,采用Fura 2 /AM与细胞内游离Ca2 + 结合 ,检测其荧光强度 ,研究不同力学条件下细胞内游离Ca2 + 浓度的变化情况 ;另外 ,分别以f MLP和TNF两种刺激因子作用中性粒细胞 ,使之激活 ,与此同时考察流体力学作用对中性粒细胞激活程度的影响。结果显示 :定常剪切流 ,切变率由低变高时 ,中性粒细胞内的游离Ca2 + 水平先是显著下降 ,切变率达到一定程度后 ,[Ca2 + ]i逐渐回升 ,并且会超过静止时的水平 ;两种刺激因子在静态下激活中性粒细胞均可使游离Ca2 + 大幅度上升 ,同时给予定常流作用 ,在较低切变率作用下 ,这一上升被明显抑制 ,当切变率升高到一定程度后 ,[Ca2 + ]i回复到静态激活水平甚至更高。正弦振荡剪切作用于中性粒细胞 ,[Ca2 + ]i随最大切变率增大而升高 ,当激活剂和剪切流同时作用时 ,[Ca2 + ]i随最大切变率升高而下降 ,逐渐接近最大切变率相同时的单纯振荡切应力作用的水平。由此我们认为 :体内不同血流环境将影响中性粒细胞的 [Ca2 + ]i,在不同循环部位的血管血流中 ,流体切应力对中性粒细胞的 [Ca2 + ]i有着不同的调节作用。

一种简便、准确的血清氧化及还原型辅酶II的分光光度测定法的建立

由于辅酶 II在正常细胞稳态及许多代谢异常中均非常重要 ,寻找一个简便而可靠的方法测定氧化型及还原型辅酶 II对于了解机体的氧化还原稳态将非常有益。本法是对 Nisselbam法稍加改进 ,运用一个敏感的酶循环反应以分光光度法测定血清中的辅酶 II,结果显示标准曲线线性关系良好 ,加样回收较完全。用本法测定的 2 7例健康献血员 ,血清 NADPH、NADP+ 及其比值 NADPH/ NADP+ 分别为 8.385± 1.5 16 nm ol/ ml,3.6 2 4± 0 .985nmol/ m l,2 .36 12± 0 .80 5 ,男女性别无明显差异。本法灵敏、准确、重现性好、费用低、操作简便 ,是测定氧化型及还原型辅酶

N-乙酰-L-半胱氨酸对H_2O_2引起的血管内皮细胞损伤的拮抗效应

目的 观察N 乙酰 L 半胱氨酸 (NAC ,痰易净 )对H2 O2 引起的血管内皮细胞损伤的影响。方法 通过测定乳酸脱氢酶 (LDH)释放率和脂质过氧化物 (LPO)值 ,MTT法测定细胞增殖活性 ,流式细胞术测细胞凋亡率 ,研究体外培养的人脐静脉内皮细胞在不同浓度H2 O2 作用下的细胞损伤及凋亡 ,以及NAC对抗细胞损伤及凋亡的效应。结果 随着H2 O2 浓度增加 ,细胞凋亡率明显增高 ,细胞增殖活力降低 ,细胞脂质过氧化物生成增加 ,LDH释放率增加 ,并在一定范围内呈剂量 效应关系。在H2 O2 中同时加入 0 5mmol/LNAC ,可使细胞活力增强 ,凋亡率降低 ,细胞脂质过氧化物生成显著减少 ,LDH释放率降低。结论 NAC可以对抗H2 O2 引起的血管内皮细胞损伤。

用自制新型荧光剂EPQS标记蛋白质及其荧光纸层析扫描测定

用自行研制的新型水溶性荧光剂EPQS分别标记人血清白蛋白(HSA)、牛血清白蛋白(BSA)和猪胰岛素(Insulin),经乙酸纤维素薄膜电泳纯化后,作荧光纸层析扫描,测得EPQS-HSA、EPQS-BSA和EPQS-Insulin的荧光光谱(λ_(em))分别为470、465、468nm,激发光谱(λ_(ex))分别为370、373、371nm;EPQS的λ_(em)为476nm,λ_(ex)为382nm。表明EPQS能用于蛋白质的标记。用EPQS定量HSA,结果显示,1～5μg的EPQS-HSA作荧光纸层析扫描,其结果与荧光强度有良好的线性关系。