免疫电镜技术在微波辐射致大鼠海马突触结构损伤研究中的应用

目的:通过免疫电镜技术的应用,探讨微波辐射致大鼠海马突触结构损伤的机制。方法:采用30mW/cm2微波辐射Wistar大鼠,通过电镜观察辐射后6h海马突触结构改变;采用不同实验条件摸索胶体金标记的免疫电镜染色方法,并检测磷酸化突触素I和囊泡氨基酸递质转运体的改变。结果:30mW/cm2微波辐射后大鼠海马突触前囊泡堆积,活性区延长、突触后致密物增加、突触曲率增加,GABA囊泡转运体和磷酸化突触素I(Ser-553)在海马堆积囊泡中表达增加。结论:胶体金标记的免疫电镜染色操作过程中,固定液中戊二醛浓度和处理时间对其结果影响至关重要;微波辐射可引起突触结构损伤,Ser-553位点突触素I磷酸化参与微波辐射所致GABA能囊泡的堆积。

微波辐射对大鼠海马结构和功能的影响及突触素Ⅰ在其中的作用

目的探讨微波辐射对大鼠空间学习记忆功能、海马组织结构、苔藓纤维出芽及其与突触素Ⅰ表达的影响。方法实验选用雄性Wistar大鼠,随机分为假辐射组及辐射组,采用30 mW/cm2微波辐射Wistar大鼠,于辐射后6 h、1 d、2 d、3 d、4 d、7 d、14 d以Morris水迷宫对辐照后大鼠空间学习记忆功能改变进行观察;于辐射后6 h、1 d、3 d、7 d、14 d、28 d采用HE染色和免疫荧光对大鼠海马组织结构和突触素Ⅰ表达进行观察;于辐射后7 d、14 d、28 d进行Timm染色,对学习记忆后大鼠海马苔藓纤维出芽情况进行观察。结果 30 mW/cm2微波辐射可引起大鼠海马齿状回颗粒细胞和CA3区锥体细胞损伤,锥体细胞层和颗粒细胞层部分锥体细胞及颗粒细胞固缩深染,部分胶质细胞固缩、深染,血管周围间隙增宽,辐照后6 h～7 d,30 mW/cm2组损伤程度呈逐渐加重趋势,辐射后14 d,30m W/cm2组损伤呈恢复趋势;辐射后6 h、1 d、2 d、7 d,30 mW/cm2组Morris水迷宫平均逃避潜伏期,较假辐射组明显延长(P<0.01或P<0.05);Timm染色结果显示,辐射后即水迷宫后7 d、14 d和28 d,30 mW/cm2组海马苔藓纤维出芽,与假辐射组比较,苔藓纤维出芽明显减少(P<0.01或P<0.05)。免疫荧光结果显示,微波辐射后3 d,海马CA3区及齿状回突触素Ⅰ表达明显减少,且其表达减少的部位和时间与海马神经元损伤以及苔藓纤维出芽受抑制的部位和时间一致。结论微波辐射可能通过抑制海马突触素Ⅰ的表达,导致突触结构损伤(表现为苔藓纤维出芽生长抑制),最终导致学习和记忆能力下降。

磷酸化突触素在神经元囊泡循环与递质释放中作用

目的探讨磷酸化突触素I在微波辐射所致囊泡循环和氨基酸递质释放改变中的作用。方法采用30 m W/cm2微波辐射原代海马神经元,免疫荧光染色观察辐射后1、6、12 h,1、2、3 d神经元Ser-62/67及Ser-553位点突触素I磷酸化表达改变;高效液相色谱检测辐射后6 h海马神经元氨基酸递质释放量变化;time-lapse观察辐射后6 h神经元突触囊泡循环改变;给予U0126和roscovitine进行干预,观察上述指标改变。结果 30 m W/cm2微波辐射后海马磷酸化突触素I Ser-62/67、Ser-553及磷酸化细胞外调节激酶(p-ERK)、细胞周期素依赖性激酶(Cdk5)表达明显减少,γ-氨基丁酸(GABA)释放明显减少,海马神经元囊泡循环速度减慢;辐射并给予U0126后,神经元p-ERK和Ser-62/67位点突触素I磷酸化表达明显减弱,囊泡循环速度减慢;辐射并给予roscovitine后,神经元Cdk5表达减少,Ser-553位点突触素I磷酸化表达上调,GABA释放明显增加,囊泡循环速度明显减慢。结论 30 m W/cm2微波辐射通过下调海马神经元ERK活性抑制突触素I Ser-62/67位点磷酸化而使囊泡循环受抑制,囊泡锚定障碍;通过下调Cdk5促进突触素I Ser-553位点磷酸化而利于含GABA的囊泡锚定于突触前膜,但抑制囊泡循环。

脑组织灌注固定脱水后去除冰晶方法的建立及其在微波辐射致脑损伤中的应用

目的探讨微波辐射后脑组织灌注固定脱水后3种去除冰晶的方法及其应用,寻找冰冻切片防止冰晶形成的最佳方法。方法二级雄性Wistar大鼠12只,采用30 mW/cm2微波辐射后6 h用1%戊巴比妥钠（3 ml/kg）麻醉,4%多聚甲醛50-80 ml,灌注10-15 min,开颅取海马组织,于4%多聚甲醛固定液中固定24 h后置于20%-30%的蔗糖溶液中,4℃过夜,待其沉底后取出,分别采用直接OCT胶包埋、液氮骤冷复温5 min OCT包埋及异戊烷-液氮速冻复温5 min OCT包埋处置,冰冻切片,Timms染色,光镜观察大鼠海马组织结构改变及冰晶产生情况。结果直接OCT胶包埋镜下观察,大鼠海马组织切片平整,出现较多、较大的冰晶网眼,细胞结构出现变形。液氮骤冷防冰晶法见大鼠海马组织结构完整,冰晶网眼较少且较小。异戊烷-液氮速冻防冰晶法大鼠海马组织未见冰晶组织,结构完整。结论异戊烷-液氮速冻防冰晶法是最佳的脑组织冰冻切片防冰晶方法,可客观反映微波辐射后脑组织结构变化。