铅、镉、汞、砷联合暴露SH-SY5Y细胞损伤和可能机制初探

目的探讨铅(lead,Pb)、镉(cadmium,Cd)、汞(mercury,Hg)和砷(arsenic,As)联合暴露对SH-SY5Y细胞损伤和可能作用机制。方法构建SH-SY5Y和HMC3 Transwell共培养细胞模型,另以SH-SY5Y细胞单细胞培养作为组织阴性对照,以1、10、20和40倍的Pb、Cd、Hg和As模拟混合物暴露浓度(metal mixture,MM)处理细胞,其中40 MM分别为Pb 2.00μmol/L、Cd 0.01μmol/L、Hg 0.07μmol/L和As 0.06μmol/L,以含10%胎牛血清和1%青链霉素的DMEM/F12培养基为重金属联合暴露的阴性对照;CCK8检测细胞存活率,Real-time PCR检测APP和MT1G转录水平;以ELISA检测培养基上清液中TNF-α、IL-6和IFN-γ的含量。为评估重金属联合暴露后共培养细胞的氧化应激水平,采用流式细胞术检测SH-SY5Y/HMC3暴露于0、1、10、20和40 MM金属混合物后的ROS水平,以DMEM/F12完全培养基单细胞培养SH-SY5Y作为组织阴性对照。结果Pb、Cd、Hg和As联合暴露后,共培养模型和单培养模型中的SH-SY5Y细胞生长受到抑制(P<0.05)、MT1G mRNA表达增加、APP mRNA无明显变化,上清液中TNF-α含量剂量依赖性增加趋势,IL-6和IFN-γ呈下降趋势;与单一SH-SY5Y细胞损伤指标的测定结果相比较,共培养模型中SH-SY5Y细胞生长抑制程度较轻,APP mRNA相对较低,MT1G mRNA较高,TNF-α含量增加幅度较小,IL-6和IFN-γ下降趋势更明显。随暴露浓度的升高,ROS相对含量呈剂量依赖性增加[F(4,10)=320.4,P<0.05]。ROS相对含量与MT1G呈正相关(r=0.98,P=0.0015)。结论重金属联合暴露的神经炎症反应与ROS生成相关联,共培养的HMC3细胞可减轻共培养模型中SH-SY5Y细胞损伤的程度,MT1G可能在SH-SY5Y细胞损伤过程中提供保护作用。

铅暴露对小鼠学习记忆功能的损伤作用及其机制的初步探讨

目的探讨铅暴露对小鼠学习记忆功能的损伤作用及其可能机制。方法采用Morris水迷宫检测小鼠的学习记忆能力;苏木素-伊红(HE)染色观察小鼠海马组织病理学变化;采用ICP-MS检测血铅和海马铅含量;对小鼠海马组织神经细胞进行核质分离,分别检测总NF-κB、胞核NF-κB和胞质NF-κB蛋白的表达水平;采用qRT-PCR和Western blot检测小鼠海马组织中NF-κB、BACE1、APP、Aβ和tau基因转录和蛋白表达情况。结果Morris水迷宫试验中,铅染毒小鼠穿越平台的次数低于对照组,差异在中高剂量组中有统计学意义(F=4.56,P<0.05)。而第1次到达平台的时间明显延长,差异在高剂量组中有统计学意义(F=1.67,P<0.05);ICP-MS检测发现,随着铅染毒剂量的增加,小鼠血铅和海马铅含量逐渐上升(F_(血铅)=57.69,F_(海马铅)=38.11,P<0.01);铅暴露增加阿尔茨海默症(Alzheimer’s disease,AD)相关基因转录和蛋白表达水平,尤其是染毒剂量为4 g/L时,APP、BACE1、Aβ和p-tau等指标表达水平明显高于对照组(P<0.01);铅暴露促进胞核中NF-κB蛋白表达水平明显升高,而胞质中NF-κB蛋白表达水平明显降低(F_(胞质NF-κB)=8.70,F胞核NF-κB=6.67,P<0.01)。结论铅暴露损伤小鼠的学习记忆能力,并上调AD相关基因的转录和蛋白表达水平;铅可能通过促进NF-κB蛋白从胞质转移至胞核,从而增加APP和BACE1等的表达水平,促进AD的发生发展。

铅致神经损伤AOP中NMDAR对BDNF的影响及在突触后信息传递中的效应

目的探讨铅暴露条件下,N-甲基-D-天冬氨酸受体(N⁃methyl⁃D⁃aspartate receptor,NMDAR)对脑源性神经营养因子(brain⁃derived neurotrophic factor,BDNF)的影响及其在突触后信息传递异常中的作用。方法以不同浓度梯度(0、12.5、50、100、200、300、400和500μmol/L)的铅溶液分别处理SH⁃SY5Y细胞,CCK⁃8法检测细胞的增殖活性并确定最终染毒浓度与时间。采用Real⁃time PCR法和Western blot法检测铅暴露48 h后BDNF、TrkB、p75NTR mRNA和蛋白相对表达情况。在不同浓度铅溶液中以D⁃AP5抑制NMDAR的表达,Western blot检测NMDAR亚基(NR1、NR2A和NR2B)、BDNF、TrkB、PI3K、ERK和PKC蛋白的相对表达情况。结果根据CCK⁃8结果选择铅染毒梯度为0、50、100和200μmol/L;染毒时间为48 h;随着铅染毒浓度的增加,与对照组相比,BDNF和TrkB mRNA逐渐减少,p75NTR mRNA增加(F值分别是7.656和12.402,P<0.05或P<0.01)。随着铅染毒浓度的增加,与对照组相比,BDNF表达呈现先逐渐减少后增加的变化过程,TrkB和p75NTR蛋白表达增加(F值分别是20.325和20.3425,P<0.05或P<0.01),且呈现剂量依赖性。给予D⁃AP5阻断后,与铅染毒组相比,Pb(Ac)2+D⁃AP5组的BDNF蛋白表达下调(t=3.760,P<0.01);TrkB的蛋白表达下调(t=3.231,P<0.05),p75NTR蛋白表达上调(t=4.849,P<0.01);NR2A和NR2B蛋白表达下调(t值分别是4.395和4.430,P<0.01);PI3 Kinase p110 beta蛋白表达下调(t值分别是4.518和10.068,P<0.01)。结论随着铅染毒剂量的增加,使得NMDAR亚基NR1、NR2A和NR2B表达上调,从而激活BDNF的转录和表达,激活PI3K⁃AKt信号通路。