融合荧光蛋白的纤维素酶表达与性质分析

纤维素酶是能特异性分解纤维素的一系列酶,被广泛应用于食品加工处理、衣物洗涤、农业及造纸等行业。纤维素酶通过不同的水解方式协同作用将纤维素水解为寡糖或可发酵糖。在将纤维素分解成寡糖的过程中,外切葡聚糖酶(CBH)和内切葡聚糖酶(EG)发挥了重要作用。目前关于两种酶协同作用机制和顺序尚未有明确的解释。本研究将嗜热毛壳菌来源的cbh和葡萄穗霉来源的eg分别与绿色荧光蛋白基因gfp和红色荧光蛋白基因mcherry进行融合,并电转入毕赤酵母X33进行异源表达,随后对这两种融合纤维素酶CBH-GFP和EG-MCHERRY进行了性质分析。结果表明:两种融合荧光蛋白的纤维素酶基因在毕赤酵母X33中实现了分泌表达。纯化的CBH-GFP和EG-MCHERRY的蛋白浓度与荧光强度呈正相关关系。对羧甲基纤维素钠(CMC-Na)、磷酸膨胀纤维素(PASC)、滤纸(FP)、微晶纤维素(Avicel)的活性测试结果显示,CBH-GFP对CMC-Na、PASC、Avicel均有催化活性,而EG-MCHERRY对CMC-Na、PASC具有催化活性,CBH-GFP对PASC有最高比酶活(1.1 U/mg);EG-MCHERRY对CMC-Na有最高比酶活(1.9 U/mg),对比原始纤维素酶CBH和EG对不同底物的活性,融合荧光蛋白的纤维素酶能保持85%以上的酶活。CBH-GFP和EG-MCHERRY最适反应温度分别为55和50℃,最适反应pH分别为6和5,与原始纤维素酶的相应性质一致。EG-MCHERRY和CBH-GFP蛋白浓度与其荧光强度呈线性正相关且性质相近,同时在pH为6、温度为50℃的情况下均能保持80%以上的酶活,因此可用于后续的纤维素酶协同反应机制的研究。

碳水化合物结合域CBM3对外切葡聚糖酶性质的影响

纤维素酶与底物的可及性是酶水解的主要限制因素之一.碳水化合物结合域(CBM)可以提高纤维素酶与底物的可及性,从而促进纤维素酶的酶促水解.本研究探究外源的CBM对外切葡聚糖酶(CBH)性质的影响.我们将一个外源的CBM3与CBH进行融合,并在毕赤酵母(Pichia pastoris)X33中成功表达,得到了CBM3-CBH和CBH的纯酶.比较两者对于微晶纤维素(Avicel)的结合能力和酶学性质.结果显示CBM3-CBH对Avicel的结合能力比CBH高8%,但是两者对不同底物的催化活性无显著差异.两者的最适反应温度均为60℃,最适反应pH均为6.结果表明,外源的CBM虽然能在一定程度上提高CBH对底物的结合能力,但对CBH的酶学性质没有实质性影响.本研究为探究CBM在纤维素酶催化过程中的作用机制奠定了良好的基础.