热休克蛋白90α(HSP90α)在大肠杆菌中的表达

目的 :探讨热休克蛋白 90α的生物学功能 ,获得高质量及充足的HSP90α蛋白。方法 :采用PCR的方法扩增HSP90αcDNA5’端 42 4bp片段 ,在起始密码子位置制造一个NcoI酶切位点 ,将PCR产物克隆到中间载体 ,再通过合适的酶切位点将其余片段连接到此载体 ,形成一个带有NcoI突变位点的HSP90αcDNA全长克隆。最终将HSP90α全部编码cDNA插入到pET 16b表达载体中。结果 :经诱导表达 ,SDS PAGE凝胶电泳分离显示在分子量大约 83kD处有一诱导蛋白带。WesternBlot证明表达产物与抗HSP90α抗血清有特异的免疫反应。结论 :构建成了T7启动子控制下的HSP90α表达质粒。

表达反义单核细胞趋化蛋白-1的重组逆转录病毒对家兔动脉平滑肌单核细胞趋化蛋白-1基因表达的影响

为研究反义单核细胞趋化蛋白－１ 转基因表达对单核细胞进入动脉壁的作用，首先构建了表达反义单核细胞趋化蛋白－ １ 基因的逆转录病毒重组体，并观察它在培养的细胞中的表达。将家兔单核细胞趋化蛋白－ １ ｃＤＮＡ 反向插入到ｐＬＮＣＸ，构成ＬＮＣＸ－ａｎｔｉ－ ＭＣＰ－１ 重组病毒质粒。再将重组质粒转染φ－２ 细胞，继以φ－ ２ 细胞产生的病毒上清感染ＰＡ３１７细胞，取得Ｇ４１８ＰＡ３１７ 抗细胞克隆。上述细胞经扩增培养，收集病毒上清并感染ＮＩＨ３Ｔ３ 细胞后进行检测。结果发现，病毒的滴度为５．６×１０７ ＣＦＵＬ，感染的ＮＩＨ３Ｔ３ 细胞中有重组病毒的整合。重组病毒感染培养的家兔动脉平滑肌细胞后，用聚合酶链反应检测发现，感染的平滑肌细胞基因组ＤＮＡ中有重组病毒整合；ＲＮＡｓｌｏｔ 杂交结果显示，感染的平滑肌细胞中有反义单核细胞趋化蛋白－１ 的表达，与未感染的平滑肌细胞相比，感染的平滑肌细胞中单核细胞趋化蛋白－ １ ｍＲＮＡ 的表达明显受到抑制。结果提示，反义单核细胞趋化蛋白－ １ 逆转录病毒表达载体在培养的动脉平滑肌中能表达反义基因并抑制靶基因的表达。

热休克蛋白90_α的表达及其对体内肿瘤生长的影响

目的探讨ｈｓｐ９０α对体内肿瘤生长的影响及机理。方法利用克隆技术构建了ｈｓｐ９０α融合表达质粒ｐＭａｌｈｓｐ９０α。ＤＢＡ／２小鼠接种肿瘤细胞前，皮下注射融合蛋白，每隔１天测肿瘤大小，２５天后，５１Ｃｒ释放法测ＮＫ细胞活性。结果注射热休克蛋白组小鼠抗ｈｓｐ９０α抗体升高，肿瘤生长快，ＮＫ细胞活性低。结论ｈｓｐ９０α对肿瘤生长的影响与小鼠体内的ＮＫ细胞活性降低有关。

主要人热休克蛋白在癌组织及癌旁正常组织中表达水平的比较研究

目的对２５例喉癌及癌旁正常喉组织中几种主要人热休克蛋白的ｍＲＮＡ表达水平进行检测和比较。方法采用ｍＲＮＡ狭缝杂交的方法。ＨＳＰ２７、ＨＳＣ７０和ＨＳＰ９０β探针用ＰＣＲ方法进行制备。结果ＨＳＰ９０α和ＨＳＰ７０在喉癌组织中的表达量显著高于正常喉粘膜，平均表达量均为正常喉粘膜表达量的５倍。而ＨＳＰ２７、ＨＳＣ７０和ＨＳＰ９０β的表达量，在两种组织中变化不大。结论与其他热休克蛋白相比，ＨＳＰ７０和ＨＳＰ９０α可能在喉癌的发生过程中有更为重要的作用。进一步深入研究它们在肿瘤和正常组织中不同表达的机理，将为热休克蛋白用于喉癌的生物治疗提供理论依据。

反义热休克蛋白90β对HeLa细胞恶性表型和药敏感性的影响

目的 探讨和研究热休克蛋白 90 (hsp90 β)与肿瘤恶性表型和耐药性的关系。 方法 将hsp90 β正义、反义表达质粒及pLXSN空载体 ,lipofectin法转染HeLa细胞。G418抗性筛选。台盼蓝染色法 ,绘细胞生长图。MTT法检测细胞对药物的敏感性。软琼脂细胞集落形成实验检测肿瘤细胞恶性表型。结果 转染正义hsp90 β表达质粒的细胞生长与转染空载体细胞及HeLa细胞差别不大。而转染hsp90 β反义表达质粒的细胞生长慢于对照组细胞 ,对常用的化疗药物阿霉素 (ADM)、顺铂(CDDP)的药敏感性比对照组细胞明显升高 ,其半致死剂量仅为后两者的 1/2和 1/5 ;软琼脂集落实验表明 ,转染反义hsp90 β表达质粒的细胞集落形成能力减弱。 结论 反义hsp90 β在一定程度上抑制了HeLa细胞的生长 ,降低HeLa细胞恶性表型 ,明显增强HeLa细胞对化疗药物的敏感性。

动脉粥样硬化斑块形成时血管平滑肌细胞增生相关基因的cDNA全长克隆及其功能的初步探讨

目的 克隆动脉粥样硬化斑块形成时血管平滑肌细胞（ＳＭＣ） 增生相关基因的ｃＤＮＡ 全长，并对其功能进行初步探讨。方法 选用氧化低密度脂蛋白（ｏｘＬＤＬ） 作为刺激物作用于培养的人主动脉ＳＭＣ，利用减除杂交技术构建减除文库，克隆相关基因片段，在全长文库构建的基础上筛选相关基因的ｃＤＮＡ全长。并进行原核系统内蛋白表达及量效关系检测。结果 发现了４ 个新基因片段，克隆了一个新基因ｃＤＮＡ 全长，该基因在原核系统内有大约相对分子质量为４４ ０００ 的蛋白表达，其高表达可能与ＳＭＣ增生有关。结论 筛选克隆的新基因ＰＳＭＣＨ１ 在动脉粥样硬化斑块形成时可能有较重要的生物学作用。

反义单核细胞趋化蛋白-1转基因表达对单核细胞在动脉内膜粘附的影响

目的 了解动脉粥样硬化发病过程中单核细胞粘附并进入动脉内膜的机制 ,分析单核细胞趋化蛋白 1(MCP 1)基因表达对单核细胞粘附动脉内膜的作用。方法 以实验性高脂血及轻度氧化LDL(MM LDL)局部保留灌注的家兔股动脉为模型 ,采用DOTAP阳离子脂质体包裹LNCX anti MCP 1质粒 ,将反义MCP 1cDNA定位导入家兔股动脉鞘及周围组织 ,以原位杂交、Northern杂交及狭缝杂交法观察反义MCP 1基因的表达 ,应用扫描电镜观察单核细胞在动脉内膜粘附的情况。结果 PCR检测发现重组基因的整合 ,RNA水平的检测发现实验组有反义MCP 1mRNA的表达 ,且实验组正义MCP 1mRNA的表达量比对照组减少 ,对照组可见明显的单核细胞粘附 ,实验组则未见此现象。结论 用逆转录病毒表达载体 阳离子脂质体介导的反义MCP 1转基因表达能减少靶基因表达并抑制单核细胞在动脉内膜粘附 。

Cloning the full-length cDNA of a gene responsible for vascular smooth muscle cell proliferation in atherogenesis and study of function

To clone the full length cDNA of a gene responsible for vascular smooth muscle cell (v SMC) proliferation in atherogenesis, and study its function Methods Oxidized low density lipoprotein (ox LDL) at optimal concentration was used as the stimulant to induce v SMC proliferation in culture medium A cDNA subtractive library of v SMC proliferation specific to ox LDL stimulation was established using subtractive hybridization technique Methods, including blotting, Northern hybridization and gene sequencing, were used to clone new gene fragments By using full length cDNA screening and protein expression techniques, one full length cDNA was cloned and its function was studied Results One full length cDNA was cloned The new gene (Genbank AF 174647) expressed a 44 kDa protein, which might be associated with the activity of ox LDL Conclusion The new gene cloned may be associated with SMC proliferation in atherogenesis