暗黑鳃金龟碱性磷酸酶HpALP的基因克隆、表达及其与Bt Cry8Ea3的结合特性

【目的】明确苏云金芽胞杆菌Bacillus thuringiensis(Bt)晶体蛋白对暗黑鳃金龟Holotrichia parallela幼虫的杀虫机制。【方法】基于暗黑鳃金龟转录组数据,PCR克隆暗黑鳃金龟碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)基因HpALP全长cDNA序列;利用原核表达系统在体外表达HpALP,并进行Western blot检测;利用qRT-PCR测定HpALP在暗黑鳃金龟3龄第2天幼虫不同组织(前肠、中肠、直肠、回肠、马氏管、脂肪体和体壁)中的表达水平;利用配体印记实验及ELISA技术对HpALP蛋白与苏云金芽胞杆菌晶体蛋白Cry8Ea3体外结合特性进行分析。【结果】得到了暗黑鳃金龟HpALP全长cDNA(GenBank登录号:MZ004964),长1536 bp,编码512个氨基酸,预测蛋白质分子量为57.32 kD,等电点为4.70;HpALP与食粪金龟Onthophagus taurus ALP的氨基酸序列一致性最高;原核表达获得重组蛋白HpALP,经Western blot检测HpALP重组蛋白在IPTG诱导8 h时的表达量最高。qRT-PCR分析的组织表达谱结果表明,HpALP在幼虫前肠中丰度最高。HpALP重组蛋白可以与Cry8Ea3特异结合,解离常数Kd值为76.21±26.44 nmol/L,最大亲合力Bmax值为0.59±0.068;而HpALP重组蛋白与对照Cry1Ab35不结合,Kd值为142.50±137.30 nmol/L,Bmax值为0.013±0.005。【结论】分离鉴定了暗黑鳃金龟HpALP蛋白,它与Bt Cry8Ea3亲和力强,推断其为Cry8Ea3的受体蛋白。研究结果为明确Cry8Ea3蛋白对暗黑鳃金龟的作用机制提供了理论依据。

Bt Cry2Ab对美国白蛾的杀虫活性及与几种中肠受体蛋白体外结合特性分析

美国白蛾(Hyphantria cunea)是危害我国蚕区桑树的重要害虫之一,为明确苏云金杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)杀虫晶体蛋白对其作用机制,本文利用大肠埃希菌表达苏云金杆菌Bt Cry2Ab蛋白,在活性测定基础上进行毒素蛋白与美国白蛾中肠类钙黏蛋白(cadherin)功能区(HcCAD-1、HcCAD-2)、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase)HcALP1、HcALP3的结合特性分析。原核表达并纯化的Bt Cry2Ab蛋白用美国白蛾3龄幼虫进行生物测定,对幼虫生长发育抑制作用明显,当质量浓度为224 mg/L时抑制率为71.14%,抑制中浓度为68.44 mg/L。将Bt Cry2Ab毒素分别与美国白蛾HcCAD-1、HcCAD-2、HcALP1、HcALP3重组蛋白进行体外配体印迹试验,Bt Cry2Ab与HcCAD-2、HcALP1重组蛋白发生特异结合,而与HcCAD-1、HcALP3不结合,推测HcCAD-2、HcALP1可能为美国白蛾Bt Cry2Ab蛋白的中肠受体蛋白。

红树莓果蝇的种类鉴定和高效诱集及田间发生规律

【目的】研究红树莓果蝇严重危害果实、降低其商品性能等制约红树莓产业发展的瓶颈问题,为红树莓果蝇的精准防控提供理论依据,为其高效诱集提供可靠技术。【方法】于红树莓田采用糖醋液对果蝇进行诱集,并于室内对果蝇种类进行形态学和分子生物学鉴定;利用诱捕器,分别采用糖醋液、自制食诱剂等9种不同配方的食诱剂,进行田间诱捕效果的比较试验;利用筛选出的高效食诱剂配方对红树莓果蝇田间发生动态进行监测。【结果】试验共诱集到果蝇成虫12115头,经形态学与DNA条形码技术鉴定发现,在红树莓田里发现的果蝇有4种,其分别为斑翅果蝇Drosophila suzukii、黑腹果蝇D.melanogaster、海德氏果蝇D.hydei和伊米果蝇D.immigrans,其占比分别为89.68%、5.71%、2.28%和2.33%,其中斑翅果蝇为优势种;比较9种食诱剂对红树莓田中果蝇的诱集效果后发现,自制糖醋菠萝香精食诱剂(其有效成分与配比为5%的红糖、5%的食醋、1%的菠萝香精)的诱虫效果最好;在对红树莓田中4种果蝇成虫动态的监测中发现,斑翅果蝇成虫在河北省保定地区2019年的发生期为5月8日—11月13日,其发生盛期为8月7日—10月9日,其发生高峰日期分别为6月19日、8月14日和10月2日。【结论】红树莓田中果蝇的优势种为斑翅果蝇;自制糖醋菠萝香精食诱剂(其有效成分与配比为5%的红糖、5%的食醋、1%的菠萝香精)对树莓果蝇的诱集效果最优;斑翅果蝇在红树莓结果期的危害严重,因此在红树莓开花始期就应对该虫进行防控,以保证树莓果品质量。