杨浦链霉菌WLU210的筛选、鉴定及其对苦瓜枯萎病的生防作用研究

本研究从河南黄河湿地采集土壤样品,采用梯度稀释涂布平板法分离和平板对峙培养法筛选获得一株对苦瓜枯萎病菌具有稳定拮抗活性的链霉菌WLU210。在形态学鉴定和生理生化特征测定的基础上,对菌株WLU210的16Sr RNA基因序列进行比对分析,将WLU210鉴定为杨浦链霉菌Streptomyces yangpuensis;拮抗谱测定结果表明,杨浦链霉菌WLU210对苦瓜枯萎病菌、苹果轮纹病菌、小麦茎基腐病菌、辣椒疫霉病菌、西瓜炭疽病菌、小麦全蚀病菌和玉米大斑病菌等7种植物病原菌均具有一定的拮抗活性;盆栽试验和田间试验结果表明,杨浦链霉菌WLU210发酵液具有有效防治苦瓜枯萎病和促进苦瓜生长的作用,田间防治效果达68.89%。由此可见,杨浦链霉菌WLU210具有作为防治苦瓜枯萎病生防菌剂研发的潜力。

河南黄河湿地放线菌多样性及植物病害生防放线菌的筛选

【目的】探究河南黄河湿地放线菌多样性,筛选对植物病原菌有拮抗活性的放线菌菌株。【方法】基于Illumina HiSeq技术的高通量测序分析了河南黄河湿地放线菌物种多样性及其分布特点;利用8种分离培养基对采集自三门峡黄河湿地、郑州黄河湿地和开封黄河湿地21份土壤样品中的放线菌进行了分离纯化,通过16S rRNA基因序列分析对分离株进行了初步的分类鉴定和系统学研究;以7种植物病原菌为靶标筛选有拮抗活性的分离株,并对活性菌株进行了聚酮合酶、非核糖体多肽合成酶和安莎类化合物等基因筛查。【结果】高通量测序结果表明,河南黄河湿地放线菌物种多样性丰富,且不同湿地区域以及同一湿地不同生境间放线菌多样性存在显著差异,放线菌优势属物种依次为Nocardioides、Streptomyces、CL500-29 marine group、Fodinicola、Mycobacterium和Micromonospora,此外,还具有大量的未知类群;通过分离培养共获得了261株纯培养菌株,分布于放线菌门中的7个目9个科9个属,包含97个可能的已知物种和8个潜在新物种,对植物病原菌有拮抗活性的放线菌86株,其中74株中至少含有一种活性代谢物质合成相关基因。【结论】河南黄河湿地放线菌物种多样性丰富,具有发掘新物种和新型植物病害生防资源的潜力。

苦瓜枯萎病菌过氧化氢酶基因FoCat1致病功能分析

由尖孢镰孢菌苦瓜专化型(Fusarium oxysporum f. sp.momdicae Sun&Huang)引起的苦瓜枯萎病是一种严重影响苦瓜生产的土传维管束病害。本研究利用分割标记的方法构建FoCat1基因的敲除片段,通过PEG介导的原生质体转化方法对FoCat1基因进行敲除,经4对引物验证得到1个阳性转化子ΔFoCat1-3。突变体ΔFoCat1-3在PDA培养基上的菌落大小、菌丝形态、产孢量等生物学特性与野生型相比均无显著性差异,但是其抵抗外源氧胁迫的能力明显减弱,对苦瓜的致病力明显下降。DAB染色结果显示,接种突变体的苦瓜叶片中过氧化氢的含量明显高于接种野生型菌株的苦瓜叶片。研究结果表明,FoCat1可能不参与病菌正常营养生长过程的调控,但是具有清除寄主产生的活性氧,来减弱寄主对病原菌的杀伤作用的功能,从而参与病原菌的致病过程。

苹果轮纹病菌(Botryosphaeria dothidea)果胶裂解酶基因Bdpl1的致病功能分析

由葡萄座腔菌(Botryosphaeria dothidea)引起的苹果轮纹病是影响我国苹果安全生产的重大病害之一。因此,本研究基于受苹果轮纹菌侵染的苹果组织中果胶裂解酶基因Bdpl1表达上调这一现象,通过Split-marker PCR技术构建Bdpl1基因敲除载体,并通过PEG介导的原生质体转化获得转化子,经常规PCR和qRT-PCR对所获得的转化子进行筛选,成功获得1个Bdpl1基因缺失阳性突变子。该转化子在PDA上的培养基性状与野生型没有明显差异,但在果胶培养基上菌落直径明显小于野生型。其胞外果胶酶活相比野生型明显下降,但在离体'早富'苹果枝条上的致病力并没有明显的下降。通过qRT-PCR技术发现在基因Bdpl1敲除后,其家族内有3个基因在病菌侵染过程中相比野生型明显上调表达(>3倍)。这些现象表明果胶裂解酶基因Bdpl1与病原菌的营养生长过程关系不大,但其参与对寄主果胶类物质的降解。Bdpl1基因对轮纹病菌致病力的影响较小,有可能是Bdpl1基因敲除后,该基因家族内其他基因的上调表达补偿了Bdpl1基因的功能。

河南省不同类型土壤可培养放线菌多样性及拮抗活性菌株筛选

分别从河南省濮阳、南阳、信阳、三门峡和商丘等地区采集潮土、黄棕壤、水稻土、褐土、盐碱土等土壤样品45份,采用8种不同的分离培养基对土壤放线菌进行分离和培养;通过16S rRNA基因序列分析对可培养放线菌进行分类鉴定;以7种植物病原菌为靶标,通过对峙培养筛选拮抗活性菌株,并对具有拮抗活性菌株的次级代谢产物合成相关基因进行初步筛查.结果表明,从5种类型土壤中分离得到放线菌分离物955株,分布于放线菌门的10个目12个科17个属,包含626个物种,其中9个分离物为潜在的新种;分离物中链霉菌属菌株751株,占分离菌株的78.64%,为最主要的优势菌属,稀有放线菌204株,占21.36%;不同类型土壤放线菌的分离频率存在一定的差异,其中褐土分离的放线菌数量最多,水稻土的分离数量最少,但是各类型土壤分离的可培养放线菌在属水平上差异不大;筛选获得对植物病原菌有拮抗活性的菌株392株,占总分离物的41%,其中链霉菌332株,占总拮抗活性菌株的84.7%,稀有放线菌60株,占总拮抗活性菌株的15.3%,且多数活性菌株含有多种生物活性物质合成相关的功能基因.由此可见,河南省土壤放线菌多样性丰富,并蕴藏丰富的稀有放线菌和拮抗活性放线菌资源,具有发掘放线菌新物种和新活性化合物的潜力.(图4表6参33附表1)