Cu^2＋-Aβ复合物与Aβ单体诱导神经元H2O2释放作用的比较研究

目的:比较不同摩尔比Cu^(2+)-Aβ复合物与Aβ单体诱导神经元H_2O_2释放作用的差异。方法:制备不同摩尔比(0.1-5)的Cu^(2+)-Aβ复合物,通过检测硫磺素T(Thioflavin T,Th T)荧光强度考察Cu^(2+)对Aβ纤丝形成的影响。利用原代培养的大鼠海马神经元细胞,分别以不同摩尔比Cu^(2+)-Aβ复合物,不同浓度Cu^(2+)-Aβ复合物(摩尔比为1),以及Aβ单体和Cu^(2+)处理细胞,检测培养上清中的H_2O_2含量;分离线粒体,分别检测不同浓度Cu^(2+)-Aβ复合物(摩尔比为1),以及Aβ单体和Cu^(2+)处理后H_2O_2的释放;观察不同摩尔比Cu^(2+)-Aβ复合物,不同浓度Cu^(2+)-Aβ复合物(摩尔比为1),以及Aβ单体和Cu^(2+)对神经元细胞活力的影响。结果:(1)Th T荧光试验结果表明,Cu^(2+)与Aβ(10μM)摩尔比为1~5范围内可明显抑制Aβ纤丝形成。(2)Cu^(2+)-Aβ复合物(摩尔比为1~5;Aβ浓度为10μM)以及摩尔比为1的Cu^(2+)-Aβ复合物(Aβ浓度分别为5,10μM)可显著诱导神经元释放H_2O_2;另外,摩尔比为1时,Cu^(2+)-Aβ复合物还可诱导神经元线粒体内H_2O_2释放;上述作用均强于Aβ单体或Cu^(2+)。(3)Cu^(2+)-Aβ复合物(摩尔比为1~5)可显著降低神经元细胞活力,该作用强于Aβ单体或Cu^(2+)。结论:与Aβ单体相比,Cu^(2+)-Aβ复合物诱发神经元细胞及其线粒体释放H_2O_2作用更强,并诱发更为明显的神经元毒性。提示Cu^(2+)与Aβ之间的配位结合可能增强其引发活性氧释放以及神经元毒性反应;Cu^(2+)-Aβ复合物引发的活性氧可能主要来自线粒体。

Cu^2＋对 AChE 诱导β－淀粉样蛋白聚集作用的影响

目的：观察生物活性过渡金属离子Cu^2＋对乙酰胆碱酯酶（acetylcholinesterase ，AChE）诱导阿尔茨海默病关键致病分子β－淀粉样蛋白（β－amyloid ，Aβ）聚集作用的影响。方法将Cu^2＋，Аβ1－40和AChE按照200∶100∶1摩尔比混合，于37℃进行孵育。应用Thioflavin T（ThT）荧光实验和透射电镜技术观察Aβ纤丝形成；应用考马斯亮蓝上清蛋白测定法观察Aβ聚集物的形成。结果（1）ThT荧光实验和电镜结果表明，Cu^2＋能够增强AChE诱导Aβ纤丝形成作用；（2）考马斯亮蓝上清蛋白测定结果显示， Cu^2＋可促进AChE诱导的Aβ聚集物形成。结论 Cu^2＋能够增强AChE诱导Aβ聚集的作用。

Aβ-Cu复合物与Aβ纤丝对小胶质细胞激活作用比较研究

目的:比较具有氧化还原活性的过渡金属离子Cu^(2+)(Cu)诱导形成的Aβ聚集物(Aβ-Cu复合物)与Aβ自聚集形成的纤丝(Fibrillar Aβ,f Aβ)对小胶质细胞激活作用的差异。方法:制备Aβ-Cu复合物和fAβ,利用小鼠BV-2小胶质细胞株,分别以不同浓度的Aβ-Cu复合物和fAβ于37℃刺激24 h,检测细胞上清液中的TNF-α(Tumor necrosis factor-α)、NO(Nitric oxide)以及H_2O_2(Hydrogen Peroxide)的含量。分别收集Aβ-Cu复合物和f Aβ作用24 h后的大鼠原代小胶质细胞条件培养液,通过观察该条件培养液对大鼠原代海马神经元细胞活力的影响,评价小胶质细胞介导的间接神经元毒性。结果:(1)在不引起直接神经毒性剂量(2.5μM)下,Aβ-Cu复合物激活小胶质细胞释放TNF-α(P<0.01)、NO(P<0.05)以及H_2O_2(P<0.05)的作用强于f Aβ。(2)在此剂量下,Aβ-Cu复合物通过激活小胶质细胞引起的间接神经元毒性强于fAβ(P<0.05)。结论:与fAβ相比,非神经毒性剂量的Aβ-Cu复合物对于小胶质细胞具有更强的激活作用,并由此引发更为明显的神经元毒性。

SK3钾通道通过PI3K/Akt-ERK通路介导Cu^(2+)-Aβ复合物所致小胶质细胞激活

目的:探讨Ca2+激活的小电导SK3钾通道在Cu^(2+)-Aβ复合物(Cu-Aβ)所致小胶质细胞激活中的作用及下游信号通路。方法:应用Cu-Aβ激活BV2小胶质细胞,采用ELISA和Amplex Red试剂盒检测细胞培养上清中肿瘤坏死因子(TNF-α)和过氧化氢(H2O2)的含量,应用qPCR和Western blot检测钾通道m RNA和蛋白水平及相关信号通路蛋白的磷酸化。结果:(1)应用不同离子通道阻断剂以及不同亚型钾通道阻断剂预处理的实验结果表明,SK3通道可能介导了Cu-Aβ所致的小胶质细胞激活。(2)qPCR和Western blot检测结果表明,Cu-Aβ可上调小胶质细胞内SK3 m RNA和蛋白表达。(3)通过转染SK3-siRNA下调小胶质细胞内SK3表达水平,结果表明,下调SK3表达后显著抑制Cu-Aβ所致的小胶质细胞激活。(4)应用特异性信号分子阻断剂预处理的实验结果表明,PI3K/Akt信号和ERK信号均参与了Cu-Aβ所致的小胶质细胞激活。(5)应用相关信号分子阻断剂预处理的实验结果进一步表明,在介导Cu-Aβ诱发的小胶质细胞激活过程中,SK3通道位于PI3K/Akt-ERK信号通路的上游。结论:SK3通道通过其下游的PI3K/Akt-ERK信号通路介导Cu-Aβ所致的小胶质细胞炎症反应。