Intein融合表达鸡IL-2蛋白的多克隆抗体制备

鸡白介素-2(chIL-2)是一种对T淋巴细胞、B淋巴细胞和自然杀伤细胞复制与分化起重要作用的细胞因子,并在机体天然免疫和获得性免疫的发生与维持中发挥重要作用。本研究中,将去除去了N-端信号肽的chIL-2基因(366bp)克隆连接到pTYB1原核表达载体,将chIL-2基因与1 362bp的Intein基因融合在同一开放阅读框内,编码相对分子质量约为71 000的chIL-2-Intein融合蛋白。诱导表达chIL-2-intein融合蛋白,应用chitin-sepharose亲和层析进行融合蛋白纯化。用纯化的chIL-2-intein融合蛋白免疫大白兔制备多克隆抗体。应用昆虫细胞表达系统纯化出的chIL-2-6His蛋白作为抗原,包被ELISA板用于抗体效价的检测,Western blot分析抗体特异性。结果,应用纯化的chIL-2-intein融合蛋白成功制备特异性chIL-2抗体,效价高达4 096 000,且该抗体也能用于Intein标签蛋白的检测。

应用Intein融合的鸡IL-2蛋白制备多克隆抗体

研究Intein标签与目的蛋白chIL-2融合作为抗原,进行高效价兔抗chIL-2蛋白多克隆抗体的制备,将去除去了N-端信号肽的chIL-2基因(366 bp)克隆连接到p TYB1原核表达载体,将chIL-2基因与1 362 bp的Intein基因融合在同1开放阅读框内,编码分子量约为71 ku的chIL-2-Intein融合蛋白。诱导表达chIL-2-Intein融合蛋白,应用Chitin-Sepharose亲和层析进行融合蛋白纯化。用纯化的chIL-2-Intein融合蛋白免疫大白兔制备多克隆抗体。应用昆虫细胞表达系统纯化出的chIL-2-6His蛋白作为抗原,包被ELISA板用于抗体效价的检测,Western Blot分析抗体特异性。结果表明:应用纯化的chIL-2-Intein融合蛋白成功制备特异性chIL-2抗体,效价高达4 096 000,且该抗体也能用于Intein标签蛋白的检测。

鸡SUMO1的HIS/GST双融合纯化标签载体的构建及表达分析

SUMO(small ubiquitin-related modifier,小泛素样相关修饰物)是一种重要的蛋白翻译后修饰物,对调节蛋白质的活性、功能和细胞定位都起着至关重要的作用。虽然SUMO和泛素的空间结构很相似,但是发挥的功能却有很大的不同,SUMO不像泛素那样介导蛋白质的降解,反而可以增强蛋白质的稳定性。近年来,研究发现人的SUMO作为一种融合标签和分子伴侣来可以显著增加一些难溶解蛋白的可溶性表达。本研究以原核表达载体pET-28a为基础构建了鸡SUMO1重组质粒HIS-SUMO1-GST-pET28a,并在SUMO1和GST之间插入IL2得到重组质粒HIS-SUMO1-IL2-GST-pET28a,经IPTG诱导表达,并分别使用Ni-NTA及Glutathione-sepharose 2次亲和层析纯化,获得了纯度较高的融合蛋白。活性分析发现去SUMO化酶人的SENP1可完全切开纯化融合的蛋白经。结果表明,此SUMO融合的HIS/GST双标签表达载体不但可以用于提高难溶蛋白的溶解度,而且表达产物也作为去SUMO化酶研究的底物。

鸡chUSP1 His594Ala突变使其去泛素化酶活性丧失

泛素特异性蛋白酶1(ubiquitin-specific proteases 1,USP1)是一种去泛素化酶,它在DNA损伤修复应答过程中发挥重要功能。已证明USP1与UAF1(USP1-associated factor 1)形成复合物后,其酶活性会得到极大的提升。chUSP1为在鸡细胞中发现的一种去泛素化酶,生物信息学分析发现它与人USP1同源性高达72%。本研究以本室扩增的chUSP1基因和chUAF1基因,使用bac-to-bac系统表达了chUSP1GG680,681AA单体及chUSP1GG680,681AA/chUAF1复合体。并根据人USP1预测将chUSP1一个可能的活性中心位点第594位组氨酸突变为丙氨酸,并纯化了此突变型的单体和复合体。应用底物Di-Ub/Ub2 WT Chains(K63-linked)及Di-Ub/Ub2 WT Chains(K48-linked)对chUSP1GG680,681AA和突变型chUSP1HGG594,680,681AA进行酶活性分析。试验结果表明chUSP1具有切割Ub链底物的酶活性,且第594位组氨酸残基突变影响chUSP1的去泛素化酶活性。而chUAF1可以与chUSP1相互作用形成复合体,并且明显提高chUSP1酶活性。

马立克氏病毒被膜蛋白VP16(UL48)的表达及多克隆抗体的制备

UL48蛋白是MDV血清Ⅰ型(MDV-Ⅰ)复制所必需,其与MDV编码的另外一种具有去泛素化酶活性的被膜蛋白UL36以及其他被膜蛋白相互作用,为探究MDV编码的UL48与UL36互作在马立克氏病(MD)肿瘤发生机制中作用,本试验制备了致病型强毒MDV-Ⅰ编码的UL48的抗体。从MDV-Ⅰ基因组中克隆了UL48基因,并将测序正确的UL48基因分别亚克隆到pTYB1和pGEX-4T3原核表达载体,构建成pTYB1-UL48和pGEX4T3-UL48重组质粒。将两重组质粒分别转化到BL21(DE3)E.coli中,分别进行IPTG诱导表达,其中pTYB1-UL48表达的融合蛋白Intein-UL48应用Chitin-Sepharose进行亲和层析纯化,将纯化后的融合蛋白Intein-UL48作为免疫大白兔制备多克隆抗体,其中Intein标签有利于提高UL48蛋白的可溶性并提高抗体效价,pGEX4T3-UL48表达纯化的融合蛋白GST-UL48应用凝血酶进行切割得到UL48蛋白,以此为包被抗原,用于间接ELISA和Western blot抗体效价检测和特异性鉴定。结果显示该抗体效价为1:512 000,成功制备特异性的UL48抗体。