绵羊肺炎支原体P60_(58aa-928aa)蛋白的原核表达及间接ELISA方法的建立

【目的】建立基于绵羊肺炎支原体表面脂蛋白P60的间接ELISA方法。【方法】利用生物信息学软件对P60蛋白进行抗原性分析,筛选出抗原性最佳的区域,扩增目的基因后构建重组表达载体并进行基因测序,将测序正确的质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,用IPTG诱导抗原性最佳蛋白表达并进行诱导时间优化;利用SDS-PAGE分析该蛋白分子质量大小及其表达形式。以重组蛋白作为抗原,绵羊肺炎支原体阳性血清作为抗体,通过Western blotting方法分析其反应原性。以重组蛋白为包被抗原,建立抗原性最佳蛋白的间接ELISA抗体检测方法,用该方法对20份阴性血清进行检测,计算阴阳临界值;检测该方法的特异性、敏感性和重复性,并用建立的间接ELISA方法与间接血凝法对92份绵羊临床血清样本进行检测。【结果】经DNAStar分析,P60蛋白第58-928位氨基酸区域的平均抗原指数在0.8~1.7之间,亲水指数为0~2.0,证明该区域(P60_(58aa-928aa))抗原性和亲水性较强;通过PCR扩增得到P60_(58aa-928aa)基因,并构建重组表达载体,通过基因测序证明该重组表达载体与预期结果一致。SDS-PAGE结果显示,IPTG诱导浓度为1 mmol/L,诱导10 h时蛋白表达量较高,蛋白分子质量为42 ku,在大肠杆菌中以包涵体的形式表达;Western blotting结果表明,构建的重组蛋白具有良好的反应原性。对ELISA各条件进行优化结果显示:抗原包被浓度为0.5μg/mL,一抗最佳稀释浓度为1∶100,最佳孵育时间为1.5 h,酶标二抗最佳稀释倍数为1∶4000,判定阴阳性血清的临界值为0.36。对口蹄疫病毒(FMDV)、小反刍兽疫病毒(PPRV)、布氏杆菌(Brucella)、牛支原体(Mb)、丝状支原体山羊亚种(Mmc)的标准阳性血清的检测均为阴性,证明该方法特异性较强;敏感性试验结果表明,血清稀释度为1∶2048时仍为阳性;批内重复试验和批间重复试验的变异系数均<10%,证明该方法具有较好的重复性。利用所建立的间接ELISA方法与间接血凝法对92份羊血清检测结果表明,二者的阳性符合率为81.6%,阴性符合率为92.6%,总符合率为88.0%。【结论】本研究建立的间接ELISA方法可用于临床样本的检测,为绵羊肺炎支原体的疫苗免疫效果评价和疾病诊断提供了较为可靠的方法。

BPIV3 NP蛋白的原核表达及其对BPIV3灭活疫苗免疫增强作用的研究

【目的】验证牛副流感病毒3型(Bovine parainfluenza virus type 3,BPIV3)NP蛋白对BPIV3灭活疫苗的免疫效果是否有增强作用。【方法】利用生物信息学软件对NP基因编码的蛋白进行抗原性分析,筛选出抗原性区域,采用PCR方法扩增BPIV3截短的NP基因序列,连接至pET-32a(+)质粒上,通过大肠杆菌原核表达系统和Ni亲和层析的方法获得了较高纯度的BPIV3 NP蛋白,经Western blotting验证其反应原性。将BPIV3用0.3%甲醛灭活后与弗氏佐剂1∶1混合制备灭活疫苗。8只新西兰白兔随机分为4组:灭活疫苗组、NP蛋白组、灭活疫苗和NP蛋白混合组及对照组,每组2只。免疫前及免疫后每7 d采集血液分离血清,采用间接ELISA方法和病毒中和试验测定并比较4组新西兰白兔特异性抗体和中和抗体的水平。【结果】经DNAStar分析,NP蛋白第193-368位氨基酸处的平均抗原指数在0.4~1.7之间,亲水指数为0~1.5,证明该区域抗原性和亲水性较强;通过PCR扩增得到NP基因,并构建重组表达载体,通过基因测序证明该重组表达载体与预期结果一致;SDS-PAGE结果显示,NP蛋白表达量较高,蛋白分子质量为50 ku且以包涵体形式表达;Western blotting结果表明,所表达的蛋白具有较强的反应原性;ELISA结果显示,在免疫后28 d,对照组的特异性抗体效价为0,灭活疫苗组、NP蛋白组及灭活疫苗和NP蛋白混合组的特异性抗体效价分别达到1∶2^(11)、1∶2^(17)和1∶2^(18)。病毒中和试验结果显示,在免疫后28 d,对照组中和抗体效价为0,灭活疫苗组、NP蛋白组及灭活疫苗和NP蛋白混合组的中和抗体效价分别为1∶2^(3.32)、1∶2^(4.48)和1∶2^(4.98)。【结论】BPIV3 NP蛋白可增强BPIV3灭活疫苗的免疫效果,在灭活疫苗中加入NP蛋白可作为BPIV3灭活疫苗的新型接种方法。

牛病毒性腹泻病毒对新西兰白兔致病性分析及E2蛋白免疫效果的评价

【目的】研究牛病毒性腹泻病毒(BVDV)感染对新西兰白兔的致病性以及BVDV E2重组蛋白的免疫效果。【方法】将实验室培养保存的BVDV病毒纯化并按照Reed-Muench法测定其病毒滴度。在致病性试验中,将10只新西兰白兔随机分为感染组和对照组,每组5只。感染组用1 mL纯化的BVDV病毒攻毒(滴鼻500μL、耳缘静脉注射500μL),对照组用等体积的生理盐水处理,连续3 d,每天1次,每天观察各组兔的临床症状并测量体温;分别于接种病毒后第6、9、12、15、17天通过耳缘静脉采集血液检测血常规;感染病毒第17天采集鼻拭子进行RT-PCR鉴定,采集后剖杀并采集气管、肺脏、脾脏和小肠组织,制备病理切片观察病理变化。在免疫效果评价试验中,将10只新西兰白兔随机分为免疫组和对照组,每组5只,免疫组用E2重组蛋白(1 mg/只)与佐剂混合后经肌内多点注射免疫新西兰白兔,对照组接种等体积生理盐水;共免疫2次,2次免疫间隔为14 d。在一免后0、7、14、21、28 d采集血清,通过间接ELISA方法检测血清中抗重组蛋白特异性抗体水平;在一免后第28天按致病性试验中方法攻毒,在攻毒第17天采集鼻拭子进行RT-PCR鉴定,采集气管、肺脏、脾脏和小肠组织制备病理切片观察病理变化及免疫组织化学检测。【结果】纯化后BVDV的病毒滴度为4.16×10~6 TCID/mL。与对照组相比,感染组部分新西兰白兔6 d内活动减少,采食略微减少,6 d后逐渐恢复正常,在感染第13天出现腹泻症状,从第5天开始体温略微升高,但均在正常范围内波动。与对照组相比,在攻毒第6和9天,感染组白细胞和血小板分别显著和极显著降低(P<0.05;P<0.01);在攻毒第12、15和17天,感染组白细胞、血小板和淋巴细胞均极显著降低(P<0.01)。鼻拭子RT-PCR检测为阳性,气管、肺脏、脾脏及小肠组织表现出轻度至重度的组织病理学变化。间接ELISA检测结果表明,在一免后7 d时,血清抗体滴度为1∶16~1∶32;在一免后28 d时,血清抗体滴度为1∶256~1∶512;免疫攻毒组新西兰白兔鼻拭子经RT-PCR检测为阴性;组织病理学观察显示,免疫攻毒组气管及肺脏表现出轻微的组织病理学变化。免疫组化检测结果显示,免疫组结果均呈阴性,对照组结果均为阳性。【结论】通过滴鼻及耳缘静脉注射BVDV的方式可以构建新西兰白兔致病模型,BVDV E2亚单位疫苗能够刺激机体产生特异性抗体,起到免疫防御的作用。

基于gB蛋白的牛传染性鼻气管炎间接ELISA检测方法的建立

为建立一种针对牛传染性鼻气管炎病毒(Infectious bovine rhinotrachetitis virus,IBRV)的早期快速检测方法,并能判定免疫后是否再次发生感染,本研究利用原核表达IBRV gB蛋白,并通过SDS-PAGE和Western blot检测gB蛋白的表达,并初步建立基于gB蛋白检测IBRV的间接ELISA方法。结果表明:1)对IBRV标准阳性血清,本试验方法的最低检测限度为1∶4096,说明建立的gB-ELISA检测方法具有较高的敏感性。2)该方法对其他4种常见的牛疫病阳性血清检测均为阴性,不存在交叉反应,表明该方法具有良好的特异性。3)在对200头牛的临床样品的检测中,该方法与IDEXX(IBRV gB X3)抗体检测试剂盒符合率高达97.5%。综上,本研究建立的gB-ELISA检测方法敏感性高,特异性好,该方法为开发一种在感染早期快速对疾病进行诊断,并可以判定疫苗免疫后是否再次发生IBRV感染的试剂盒奠定基础。

抗体检测胶体金免疫层析技术中不同拦截模式的初步比较研究

胶体金免疫层析技术是以胶体金作为示踪标志物,应用于抗原抗体反应中的一种新型快速检测技术,目前国内外对于抗体检测胶体金免疫层析技术中不同拦截模式的比较研究较少。本研究将牛传染性鼻气管炎病毒(infectious bovine rhinotracheitis virus,IBRV)的gD基因进行了原核表达,以纯化的IBRV gD-pAb作为检测靶标,将胶体金标记的g D蛋白、金黄色葡萄球菌蛋白A(staphylococcal protein A,SPA)、链球菌蛋白G(streptococcal protein G,SPG)、羊抗兔IgG分别包被于金垫,将未标记的上述4种蛋白分别包被于NC膜的检测线处,将金垫和NC膜进行组合,制备出7种抗体拦截模式的胶体金免疫层析试纸,通过比较其灵敏度、显色效果及批内重复性来评价不同拦截模式的实际性能。结果显示,标记抗原-SPG、标记抗原-SPA、标记抗原-二抗拦截模式(间接法)的灵敏度约为标记抗原-抗原拦截模式(双抗原夹心法)的200倍;间接法中标记抗原-SPG、标记抗原-SPA与标记SPG-抗原、标记二抗-抗原拦截模式的灵敏度相近,而标记抗原-二抗拦截模式及标记SPA-抗原拦截模式由于IgG结合蛋白的特性而导致试纸的灵敏度降低、显色效果及批内重复性变差;7种抗体拦截模式试纸在检测副结核分枝杆菌(Mycobacterium avium subsp.paratuberculosis,MAP)、赤羽病病毒(akabane virus,AKAV)、牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus,BVDV)、牛支原体(Mycoplasma bovis)、小反刍兽疫病毒(peste des petits ruminants virus,PPRV)、布氏杆菌(Brucella)、口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus,FMDV)的标准阳性血清时均为阴性反应;IgG结合蛋白的实际性能排序为SPG>SPA>二抗。本研究为其他疫病抗体检测的胶体金免疫层析试纸的制备提供参考。

牛传染性鼻气管炎病毒抗体检测胶体金免疫层析试纸的研制

将gD蛋白用胶体金标记并包被于结合垫作为检测探针,未标记的gD蛋白包被NC膜作为检测线,以金标记鼠IgG与羊抗鼠IgG作为独立质控系统,利用双抗原夹心法建立检测牛传染性鼻气管炎病毒(infectious bovine rhinotracheitis virus,IBRV)抗体的胶体金免疫层析试纸,并对该试纸进行了性能评价。结果显示,该试纸在检测副结核分枝杆菌(MAP)、赤羽病病毒(AKAV)、牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、牛支原体(M.bovis)、小反刍兽疫病毒(PPRV)、布氏杆菌(Brucella)、口蹄疫病毒(FMDV)的标准阳性血清时均为阴性反应;该试纸在检测IBRV标准阳性血清时敏感性为1∶16;将该试纸与进口商品化ELISA试剂盒共同检测60份待检牛血清,两者的阳性符合率为93.3%,阴性符合率为100%,总符合率为96.7%。结果表明,本试验建立的胶体金免疫层析试纸可在10~15 min完成检测,具有快速、准确、简便等特点,为临床定性检测及现场诊断牛传染性鼻气管炎提供了有效工具。