背景:目前尚未见脂肪间质干细胞体外诱导分化成多巴胺能神经元的报道,且有关脂肪间质干细胞维持多巴胺能神经元存活的机制也缺乏实验证据。目的:观察腺病毒介导胶质细胞系源性神经营养因子基因修饰的脂肪间质干细胞对共培养条件下多巴...背景:目前尚未见脂肪间质干细胞体外诱导分化成多巴胺能神经元的报道,且有关脂肪间质干细胞维持多巴胺能神经元存活的机制也缺乏实验证据。目的:观察腺病毒介导胶质细胞系源性神经营养因子基因修饰的脂肪间质干细胞对共培养条件下多巴胺能神经元存活的影响。设计、时间及地点:细胞学体外对比观察,于2007-03/12在吉林省耳鼻咽喉研究所和教育部吉林大学人兽共患病重点实验室完成。材料:3周龄Wistar大鼠、孕14 d Wistar大鼠由吉林大学白求恩医学院实验动物中心提供。方法:采用pAdTrackCV和pAdEasy-1系统构建重组胶质细胞系源性神经营养因子腺病毒。取孕14d大鼠,采用酶消化法培养中脑多巴胺能神经元。取Wistar大鼠腹股沟处脂肪,酶消化法分离培养脂肪间质干细胞,体外培养至第3代当细胞生长至60%融合时,以病毒滴度为1×109vp/mL的胶质细胞系源性神经营养因子重组腺病毒作用细胞1h后,转移到生长培养基继续培养,通过ELISA法检测培养上清胶质细胞系源性神经营养因子水平。设立3组:Ad-GDNF转染共培养组、Ad-GFP转染共培养组分别在脂肪间质干细胞经相应病毒转染24h后加入分离的多巴胺能神经元,继续培养7d;单纯多巴胺能神经元培养组不加入脂肪间质干细胞。主要观察指标:采用免疫荧光技术检测共培养环境对多巴胺能神经元存活的影响,共培养环境对胶质细胞系源性神经营养因子修饰脂肪间质干细胞分化的影响。结果:脂肪间质干细胞在pAd-GDNF转染24h后细胞上清中出现胶质细胞系源性神经营养因子蛋白,72h达高峰,pAd-GDNF对脂肪间质干细胞的转染效率约为80%。酪氨酸羟化酶免疫荧光染色结果发现,Ad-GDNF转染共培养组多巴胺能神经元存活率明显高于单纯多巴胺能神经元培养组、Ad-GFP转染共培养组(55%,15%,25%,P<0.01)。对共培养7d的细胞进行酪氨酸羟化酶免疫荧光染色,分别以波长为488nm和563nm进行单通道扫描,未发现同时表达绿色荧光蛋白和酪氨酸羟化酶的细胞,表明此共培养环境可能不具备诱导脂肪间质干细胞分化为多巴胺能神经元的条件。结论:胶质细胞系源性神经营养因子基因修饰的脂肪间质干细胞与胚胎中脑分离出的多巴胺能神经元共培养,能够维持和促进多巴胺能神经元的存活,但可能不具备诱导脂肪间质干细胞分化为多巴胺能神经元的作用。展开更多
目的观察缺氧环境下咽癌Fadu细胞间质化表型的改变与Postn蛋白表达的相关性。方法采用25μmol/L氯化钴(Co Cl2)化学缺氧方法缺氧24 h,模拟Fadu缺氧环境。采用免疫荧光法检测25μmol/L Co Cl2作用下,Postn蛋白的表达,观察上皮间质化(EMT...目的观察缺氧环境下咽癌Fadu细胞间质化表型的改变与Postn蛋白表达的相关性。方法采用25μmol/L氯化钴(Co Cl2)化学缺氧方法缺氧24 h,模拟Fadu缺氧环境。采用免疫荧光法检测25μmol/L Co Cl2作用下,Postn蛋白的表达,观察上皮间质化(EMT)相关蛋白的表达变化。通过构建postn si RNA真核表达质粒,瞬时转染Fadu细胞,观察Postn沉默对Fadu间质化蛋白标记表达的影响,采用划痕实验观察Postn沉默对Fadu细胞迁移能力。结果免疫荧光结果显示,25μmol/L Co Cl2作用细胞24 h,Postn表达明显高于正常培养组,Vimentin、Snail和Twist蛋白表达也明显高于对照组,表明低氧环境可促进Fadu细胞增殖和提高细胞间质化程度。采用Postn si RNA真核表达载体转染Fadu细胞,免疫荧光和实时定量PCR结果显示,构建的si RNA表达载体的基因沉默效率为75.43%,转染阳性的Fadu细胞Vimentin。划痕实验证实,Postn基因干扰转染阳性组,细胞迁移率与转染Control质粒的对照组相比明显降低(P<0.01)。结论 Postn蛋白高表达与Fadu细胞低氧环境下的细胞增殖和间质化有关,沉默Postn基因能够明显抑制Fadu细胞的间质化和迁移浸润能力。展开更多
文摘背景:目前尚未见脂肪间质干细胞体外诱导分化成多巴胺能神经元的报道,且有关脂肪间质干细胞维持多巴胺能神经元存活的机制也缺乏实验证据。目的:观察腺病毒介导胶质细胞系源性神经营养因子基因修饰的脂肪间质干细胞对共培养条件下多巴胺能神经元存活的影响。设计、时间及地点:细胞学体外对比观察,于2007-03/12在吉林省耳鼻咽喉研究所和教育部吉林大学人兽共患病重点实验室完成。材料:3周龄Wistar大鼠、孕14 d Wistar大鼠由吉林大学白求恩医学院实验动物中心提供。方法:采用pAdTrackCV和pAdEasy-1系统构建重组胶质细胞系源性神经营养因子腺病毒。取孕14d大鼠,采用酶消化法培养中脑多巴胺能神经元。取Wistar大鼠腹股沟处脂肪,酶消化法分离培养脂肪间质干细胞,体外培养至第3代当细胞生长至60%融合时,以病毒滴度为1×109vp/mL的胶质细胞系源性神经营养因子重组腺病毒作用细胞1h后,转移到生长培养基继续培养,通过ELISA法检测培养上清胶质细胞系源性神经营养因子水平。设立3组:Ad-GDNF转染共培养组、Ad-GFP转染共培养组分别在脂肪间质干细胞经相应病毒转染24h后加入分离的多巴胺能神经元,继续培养7d;单纯多巴胺能神经元培养组不加入脂肪间质干细胞。主要观察指标:采用免疫荧光技术检测共培养环境对多巴胺能神经元存活的影响,共培养环境对胶质细胞系源性神经营养因子修饰脂肪间质干细胞分化的影响。结果:脂肪间质干细胞在pAd-GDNF转染24h后细胞上清中出现胶质细胞系源性神经营养因子蛋白,72h达高峰,pAd-GDNF对脂肪间质干细胞的转染效率约为80%。酪氨酸羟化酶免疫荧光染色结果发现,Ad-GDNF转染共培养组多巴胺能神经元存活率明显高于单纯多巴胺能神经元培养组、Ad-GFP转染共培养组(55%,15%,25%,P<0.01)。对共培养7d的细胞进行酪氨酸羟化酶免疫荧光染色,分别以波长为488nm和563nm进行单通道扫描,未发现同时表达绿色荧光蛋白和酪氨酸羟化酶的细胞,表明此共培养环境可能不具备诱导脂肪间质干细胞分化为多巴胺能神经元的条件。结论:胶质细胞系源性神经营养因子基因修饰的脂肪间质干细胞与胚胎中脑分离出的多巴胺能神经元共培养,能够维持和促进多巴胺能神经元的存活,但可能不具备诱导脂肪间质干细胞分化为多巴胺能神经元的作用。
文摘目的观察缺氧环境下咽癌Fadu细胞间质化表型的改变与Postn蛋白表达的相关性。方法采用25μmol/L氯化钴(Co Cl2)化学缺氧方法缺氧24 h,模拟Fadu缺氧环境。采用免疫荧光法检测25μmol/L Co Cl2作用下,Postn蛋白的表达,观察上皮间质化(EMT)相关蛋白的表达变化。通过构建postn si RNA真核表达质粒,瞬时转染Fadu细胞,观察Postn沉默对Fadu间质化蛋白标记表达的影响,采用划痕实验观察Postn沉默对Fadu细胞迁移能力。结果免疫荧光结果显示,25μmol/L Co Cl2作用细胞24 h,Postn表达明显高于正常培养组,Vimentin、Snail和Twist蛋白表达也明显高于对照组,表明低氧环境可促进Fadu细胞增殖和提高细胞间质化程度。采用Postn si RNA真核表达载体转染Fadu细胞,免疫荧光和实时定量PCR结果显示,构建的si RNA表达载体的基因沉默效率为75.43%,转染阳性的Fadu细胞Vimentin。划痕实验证实,Postn基因干扰转染阳性组,细胞迁移率与转染Control质粒的对照组相比明显降低(P<0.01)。结论 Postn蛋白高表达与Fadu细胞低氧环境下的细胞增殖和间质化有关,沉默Postn基因能够明显抑制Fadu细胞的间质化和迁移浸润能力。
