紫杉醇产生菌HQD33的鉴定

通过对紫杉醇产生菌HQD33的群体形态和菌丝、分生孢子梗、产孢细胞、分生孢子等个体形态的研究 ,确定了HQD33的分类地位 ,为树状多节孢。

核盘菌arom基因的克隆及其在酿酒酵母中的表达

核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)arom基因已经被克隆、测序。该基因编码的AROM蛋白是芳香族氨基酸合成途径中催化第二步到第六步的五功能多肽。为了对扩增的核盘菌arom基因进行功能验证和探索大量获得AROM蛋白的成熟方法,克隆了arom基因的编码框序列,并将其与载体pYES2连接,构建了酵母表达载体pYES2-arom。用LiAc/SSDNA/PEG方法将该表达载体转入酿酒酵母H158(Saccharomyces cerevisiaeH158)中。酶活测定、RT-PCR和Northern杂交结果显示,核盘菌arom基因在酿酒酵母胞内获得了表达,转化子具有AROM蛋白结构域之一5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶的催化活性。不同培养时间取样样品的酶活检测结果表明,当转化子在30℃的条件下,在SC-U酵母尿嘧啶营养缺陷型选择培养基中以180r/min被振荡培养时,其外源AROM蛋白的5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶酶活在培养72h达到最高。

核盘菌5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶的酶学性质(英文)

核盘菌5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶(EPSP合酶)是AROM多功能酶的活性之一.该酶催化莽草酸磷酸(S3P)和磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)产生5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸和无机磷酸的可逆反应,受除草剂草甘膦(N-(膦羧甲基)甘氨酸)抑制.纯化了核盘菌AROM蛋白并对EPSP合酶进行了酶学特征研究.结果显示,该酶反应的最适pH值为7·2 ,最适温度为30℃.热失活反应活化能是69·62 kJ/mol .底物S3P和PEP浓度分别高于1 mmol/L和2 mmol/L时,对EPSP合酶反应产生抑制作用.用双底物反应恒态动力学Dalziel方程求得的Km(PEP)为140·98μmol/L,Km(S3P)为139·58μmol/L.酶动力学模型遵循顺序反应机制.草甘膦是该酶反应底物PEP的竞争性抑制剂(Ki为0·32μmol/L)和S3P的非竞争性抑制剂.正向反应受K+激活.当[K+]增加时,Km(PEP)随之降低,Km(S3P)不规律变化,而Ki(PEP)随[K+]增加而提高.

纤维素酶及其基因结构特征与功能的关系

纤维素是一种具有重要发展潜力的生物型能源。研究纤维素酶及其基因的结构和功能,阐明基因表达和降解机制是利用这一巨大资源的基础之一。本文综述了纤维素酶及其基因结构和功能研究的最新进展,并对其发展前景进行了分析。

5种除草剂对核盘菌生长的初步测定

在实验室条件下研究了不同浓度莠去津、百草枯、农达、2 4 D丁酯和灭草松对核盘菌菌丝生长、菌核萌发和菌核生长的影响。结果表明:5种化学除草剂均不抑制或促进核盘菌菌核的萌发;核盘菌在含有生产上推荐使用浓度的莠去津、农达和2 4 D丁酯的基本培养基上菌丝生长速度与对照相比差异不显著,而在含有推荐使用浓度的百草枯和灭草松的基本培养基上菌丝生长速度与对照相比受到极显著的抑制;推荐浓度的农达、莠去津和百草枯不影响菌核成熟,推荐浓度的2 4 D丁酯完全抑制菌核生长,而推荐浓度的灭草松部分抑制菌核生成。认为在杂草综合治理中,若使用核盘菌作为生物除草剂,可以配合使用农达和莠去津。

核盘菌EPSP合酶基因在大肠杆菌中的表达

不含有内含子的核盘菌arom基因已经被扩增、测序.该基因编码五功能的AROM蛋白.为了大量获得核盘菌AROM蛋白的结构域之一5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS),将该菌arom基因编码脱氢奎尼酸合酶(DHQS)和EPSPS两结构域的DNA序列和只编码EPSPS结构域的DNA序列分别克隆入载体pGEX-4t-2和载体pET28b中,构建了4个表达载体pGEX-DE、pGEX-E、pET-DE和pET-E,并将其转入大肠杆菌DH5α、大肠杆菌BL21(DE3)或大肠杆菌JM109中表达.酶活测定和SDS-PAGE分析结果显示,上述编码序列在大肠杆菌细胞内获得了表达,含有表达载体pGEX-E、pET-DE和pET-E的大肠杆菌BL21(DE3)转化子具有EPSPS的催化活性,说明核盘菌arom基因的这些DNA片段可以被单独表达.核盘菌EPSPS异源表达系统的建立为该酶的抑制剂设计奠定了基础.

核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)arom基因3′-末端的克隆与分析

根据五功能AROM蛋白保守区域设计简并引物,从核盘菌基因组中获得了一段大小为1626bp的DNA片段。结合Southern杂交结果,用反向PCR克隆了arom基因3′-末端4104bp的序列。序列分析结果表明,该DNA片段推测的氨基酸序列与烟曲霉、粗糙脉孢霉、构巢曲霉和粟酒裂殖酵母等的AROM蛋白同源,包含了部分5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合成酶(EPSP合成酶)结构域、莽草酸激酶结构域、脱氢奎尼酸脱水酶(脱氢奎尼酸酶)结构域和脱氢莽草酸脱氢酶结构域,其中含有EPSP合成酶模式2(255—273)、莽草酸激酶模式(426—453)和Ⅰ型脱氢奎尼酸酶活性位点模式(659-687)。

核盘菌AROM蛋白的三级结构分析

核盘菌编码AROM蛋白的arom基因已经被克隆测序,本文根据该基因翻译的氨基酸序列用同源模建方法和从头模建方法分析了AROM蛋白各结构域的三级结构和功能位点,以及该蛋白二聚体可能的组装方式。结果表明,核盘菌AROM蛋白的脱氢奎尼酸合酶结构域进一步由N-端含有一个Rossmann折叠的α/β结构域和C-端的α螺旋结构域组成;5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶结构域则由两个相似结构域组成,每个结构域含有不同拷贝数的β折叠和α螺旋;莽草酸激酶结构域的N-端由三个β折叠组成;脱氢奎尼酸酶结构域为(α2β2)3多肽,在N-端有一对反平行的β链,在C-端有loop环;莽草酸脱氢酶结构域含有一个由α/β组成的催化结构域和一个含有Rossmann折叠的NADPH结合结构域。

石油和天然气生物脱硫技术分析和展望

综述了石油和天然气生物脱硫工艺应用的最新进展,对石油和天然气生物脱硫的原理、使用的微生物种类和工艺设计进行了比较和分析,并展望了生物脱硫技术在石油和天然气工业可能的发展与应用。通过对比分析,阐述了石油、天然气和其他原料生物脱硫机理的不同和联系,以及各种工艺目前存在的问题和可能的解决方法。边远地区、低含硫油气藏的开采和微生物脱硫能力的提高及其工艺的改善,将促使生物除硫技术在石油和天然气开发中广泛应用。

树状多节孢原生质体的制备和再生

研究了酶系组成、酶解时间、酶解温度、渗透压稳定剂、pH值、培养基成分、培养方式、预处理、保护剂等因素对紫杉醇产生菌树状多节孢原生质体制备和再生的影响 .结果表明 :将树状多节孢在PDA液体培养基中静止培养 2～3d ,离心收集菌体 ,用 pH 5 .5～ 6 .0的 0 .7mol/L的NaCl配制成的含有 3%纤维素酶、2 %蜗牛酶和 1%溶菌酶的复合酶 ,30℃恒温酶解 9h ,原生质体制备率最高。但是考虑到原生质体的再生 ,以酶解 7h左右为宜 .获得的原生质体经过纯化 ,用 0 .7mol/LNaCl配制的PDA再生培养基进行双层平板培养法再生 ,原生质体的再生率最高 .本研究为以后通过原生质体诱变、转化、融合构建紫杉醇工程菌株奠定了基础 .图 3表 9参

树状多节孢发酵生产紫杉醇工艺条件的初步研究

研究了树状多节孢HQD33内生真菌融合子TPF-1摇瓶发酵工艺条件,进行了2.8L和10L通用式机械搅拌罐的发酵试验。结果表明,HQD33适宜发酵工艺条件是:发酵时间16～18d,培养基中蔗糖、苯丙氨酸、醋酸钠、酪氨酸、2,4-二氯苯氧乙酸和亚油酸的加量分别为10g/L、1mg/L、1.5g/L、15mg/L、5mg/L和15mg/L,摇瓶装量为150ml/500ml,在此条件下摇瓶发酵液中紫杉醇平均含量为448.52 g/L; 2.8L和10L罐发酵液中紫杉醇含量达406.95和395.12g/L(平均值)。

球毛壳菌几丁质酶3基因的序列分析

根据EST分析的结果 ,从cDNA文库中挑取几丁质酶 3基因的克隆进行了测序并序列分析。结果表明 :cDNA文库中几丁质酶 3基因的克隆插入片断大小为 12 6 8bp;用Phrap软件拼接出来的几丁质酶 3的表达序列标签拼接序列与实际序列不完全吻合。因此 ,在EST分析中不用Phrap软件为好。

抗癌药物紫杉醇产生菌原生质体形成及释放规律

详细研究了抗癌药物紫杉醇产生菌树状多节孢原生质体形成和释放的规律 .从酶系组成、酶解时间、酶解温度、渗透压稳定剂、pH值、培养基成分、培养方式、预处理等因素对树状多节孢原生质体形成和释放的影响进行了研究 ,得出了该菌的最佳原生质体制备条件及其规律 ,为以后通过原生质体技术构建紫杉醇产生菌的工程菌株奠定了基础 .

石油烃降解酶及其基因的结构、功能和表达调控

研究烃降解酶及其基因是进行石油微生物分子检测和工程菌构建的重要基础.本文对目前烃降解酶及其基因的结构、功能和调控机制的最新研究进展进行了总结.催化烷烃好氧降解的起始酶有几类加氧酶,膜整合甲烷单加氧酶、萘-1,2-双加氧酶和异丙苯双加氧酶的晶体结构已经被解析.烷基或芳基琥珀酸合酶催化烃厌氧代谢的主要起始反应,而Azoarcus sp.乙苯厌氧代谢起始反应由乙苯脱氢酶催化.在细菌中,烃代谢相关基因主要通过形成操纵子进行表达调控,基因转录受烃或类似物诱导,并受细胞全局调控.一些微生物由于存在多种烃代谢途径而可能具有复杂的基因调控机制.此外,生态学研究表明,环境中烃降解基因的诱导动态与实验室内纯培养分析不同.在分析石油降解工程菌构建有待解决问题的基础上,提出了烃代谢综合调控和环境中相关酶及基因诱导研究的重要性,并对未来烃降解酶及其基因在有毒物降解理论研究和生物修复上的应用进行了展望.

黑曲霉外源表达系统对Dactylellina cionopaga基因PrD Ⅰ的表达

目的:Dactylellina cionopaga是产生黏性分枝的捕食线虫真菌,进行其基因外源表达是鉴定该菌侵染相关因子的途径之一。方法:该文构建了含有组氨酸标签的黑曲霉表达载体pGT21M-HIS,对D.cionopaga中与侵染机制相关的丝氨酸蛋白酶基因PrD Ⅰ进行了外源表达。结果:RT-PCR鉴定结果显示,PrDⅠ在黑曲霉201中获得了转录。SDS-PAGE和酶活分析结果表明,经亲和层析纯化的重组蛋白分子量约为45kDa,在pH 5.0的条件下具有蛋白水解活性。纯酶液的蛋白浓度为30μg/ml。结论:构建的带有组氨酸标签的表达载体pGT21M-HIS能够用于基因在黑曲霉表达系统中的外源表达,并为目的蛋白的纯化和鉴定提供了极大便利。黑曲霉外源表达系统在表达丝状真菌基因方面相对其他表达系统具有优势。