蜜蜂慢性麻痹病毒荧光定量RT-PCR检测方法的建立

为建立慢性蜜蜂麻痹病毒(CBPV)快速诊断方法,本研究根据CBPV RNA依赖RNA聚合酶(RdRp)基因保守区设计特异性引物和TaqMan探针,建立了荧光定量RT-PCR检测方法。结果显示,以构建的重组质粒为标准品建立的TaqMan荧光定量PCR方法,标准曲线具有良好的线性关系,线性相关系数达0.998;该方法最低检出限为10拷贝/μL,与蜜蜂急性麻痹病毒等常见蜜蜂病毒无交叉反应,具有良好的灵敏性和特异性;组内和组间变异系数分别低于0.5%和2%,具有较好的稳定性。本研究建立的CBPV荧光定量RT-PCR检测方法,可用于实验室检测、流行病学调查和疫情监测。

从台湾地区输入活猪及其产品的风险分析及管理对策

在比较台湾地区活猪及其产品与大陆相关产品疫情疫病发生情况差异的基础上,开展重要猪病风险分析,以确定从台湾地区输入活猪及其产品的风险等级和不同副产品应关注的疫情疫病名单,提出有效降低疫情疫病传入风险的检疫管理措施和对策,为今后制定从台湾地区输入活猪及其产品的重点查验、快速验放等检验检疫措施,防止台湾动物疫情疫病通过输入活猪及其产品传入提供科学依据。

黄曲霉毒素B1单克隆抗体的制备与鉴定

[目的]为黄曲霉毒素类生物毒素研究提供试验参考。[方法]黄曲霉毒素B1与人血清白蛋白耦联后免疫BALB/c小鼠,取小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞进行细胞融合,通过阳性株的筛选和克隆等步骤,制备了3株稳定分泌抗黄曲霉毒素B1的单克隆抗体,用酶联免疫吸附试验测定抗体的效价和特异性。[结果]成功地筛选出能够分泌抗黄曲霉毒素B1的单克隆抗体杂交瘤细胞株,制备出对黄曲霉毒素B1具有高亲合力、高特异性的单克隆抗体。[结论]为鲜奶及奶粉的快速筛检提供了技术支持。

五株隐孢子虫18S rRNA部分基因克隆和序列分析

设计Nested PCR引物扩增牛源微小隐孢子虫Cryptospordium parvum、羊源微小隐孢子虫C. parvum、牛源安氏隐孢子虫C. andersoni、鸡源贝氏隐孢子虫C. baileyi及猪源隐孢子虫C. suis 18S rRNA基因突变区,PCR产物经克隆测序,其片段大小分别为212、213、213、213和210 bp.将测得的序列用DNAStar软件分析并与NCBI数据库中相同与相近种株序列进行相似性比较, 进行相似性分析并用TREECON软件绘制系统发育进化树.结果表明测得的5株隐孢子虫与各自相同种相似性为98.1%～100%,与其他种相似性为90.1%～98.6%.分析显示在此突变区设置特异酶切位点能区分开C. parvum, C. andersoni, C. baileyi与C. suis,位点分别是TaqI、BstUI、MseI.本研究为我国隐孢子虫分类、分子流行病学研究提供了新的方法.

A型肉毒毒素重链C片段基因的克隆及序列分析

成功克隆了A型肉毒毒素重链C片段部分基因.以肉毒梭菌(62A)基因组DNA为模板,以此基因特异性引物为介导,采用TouchdownPCR方法,从肉毒梭菌基因组中扩增出目的基因片段后,将其克隆入T载体,进行酶切鉴定和序列分析.结果表明,此基因片段与Genbank中的BoNTa基因(收录号:M30196)核苷酸序列的同源性为100%,说明目的基因得到了成功地克隆,为后续研究奠定了基础.

猪瘟病毒兔化弱毒(HCLV)疫苗株基因组全长cDNA的克隆与序列分析

根据猪瘟病毒基因组的序列设计合成了覆盖HCLV基因组全部序列的5对引物,通过RT-PCR从感染家兔脾脏中扩增获得了包含HCLV(bog cholera lapinized virus,HCLV)基因组全序列的5个cDNA片段,并将它们分别克隆至pGEM-T vector中。然后将这5个cDNA片段按它们在HCLV基因组上的位置从5’端至3’端的顺序依次通过酶切连接,一并克隆到pPoly2载体中得到HCLV基因组全长cDNA的质粒pPOHCLV。序列分析表明,HCLV基因组长度共12310bp,有一个大的ORF,编码一3898个氨基酸的多聚蛋白。其5'-NCR和3’-NCR长度分别是374nt和239nt。与非兔化毒株相比较,HCLV基因组在12133nt处有12个碱基的插入CTTTTTTCTTTT,该序列可能是病毒在适应兔体增殖过程中形成的。基于基因组全序列及其所推导的氨基酸序列的同源性分析表明,毒株的亲缘关系的远近与它们的毒力之间并没有相关性。

动物福利壁垒对中国动物及其产品与相关服务国际贸易的影响与对策建议

作者剖析了动物福利贸易壁垒成因、特征和对国际贸易的影响,指出了中国动物福利存在的问题及与发达国家的差距,评估了动物福利政策对中国动物、动物产品及相关服务出口贸易的影响。提出了构建既适合中国国情又与国际接轨的出入境动物福利保障体系的框架建议:①应积极推动中国动物福利法立法进程;②要切实提高中国动物福利保障水平;③应先行强化出入境动物福利立法;④应在进出口动物福利立法中引入企业推动模式;⑤要充分利用WTO机制应对国外动物福利壁垒;⑥要建立健全动物福利贸易壁垒预警机制;⑦要应用危害分析与关键控制点原理管理动物福利;⑧要逐步建立农场动物福利认证制度。

灭菌乳中活阪崎肠杆菌PMA-PCR检测方法的建立

本试验旨在建立灭菌乳中活阪崎肠杆菌(Enterobacter sakazakii)的PMA-PCR检测方法。将DNA染料叠氮溴化丙锭(propidium monoazide,PMA)与聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)技术结合,优化PMA最佳工作浓度和曝光时间,确定PMA-PCR区别死、活阪崎肠杆菌细胞的最佳条件。结果表明,活阪崎肠杆菌经100℃沸水处理20min可完全致死,PMA完全与死阪崎肠杆菌DNA共价交联并光解溶液中游离PMA的最佳曝光时间为15min,完全抑制死阪崎肠杆菌PCR扩增的最小PMA浓度为5μg/mL,不抑制活阪崎肠杆菌PCR扩增的最大PMA浓度为15μg/mL。经PMA处理后,在含有不同比例的死、活阪崎肠杆菌混合液中检测到活阪崎肠杆菌的最低检测限为40CFU/mL,在灭菌乳样品中检测到活阪崎肠杆菌的最低检测限为100CFU/mL。该方法为利用PMA-PCR检测食品中的活阪崎肠杆菌奠定了基础。

β-环状糊精去除蛋黄中胆固醇

研究了不同条件下对蛋黄中胆固醇去除率和β-环状糊精(β-cyclodextrin,β-CD)残留率的影响.结果表明,蛋黄经20 MPa均质,添加质量分数为8%的β-CD,经35℃混合10 min,4 000r/min离心10 min,胆固醇的去除率能够达到85%,此时β-CD的残留率为14.3%.

福州空港口岸入境旅客携带物检疫

入境旅客携带物检疫集法制性、技术性、涉外性于一身,是检验检疫工作的重要组成部分。本文通过对福州机场2005年入境旅客携带物检疫情况的分析,提出应明确重点航班、重点对象,有针对性地开展检疫工作,以提高疫情检出率和最大限度减少漏检现象的发生。

食物中毒菌多联融合毒素Hc-VT1B-SEA-VT2B-SEB的表达及免疫学特性研究

目的构建食物中毒菌多联融合毒素基因及重组表达载体,制备抗5种毒素的血清抗体。方法采用一定的linker序列(G-P-G-P-G)将克隆的3种食物中毒菌的5个毒素基因片段进行串联,并定向克隆到表达载体pET-22b(+)的NcoI和XhoI位点之间,构建五联融合毒素基因及重组表达载体,表达产物经切胶回收初步纯化后免疫獭兔,制备抗血清,利用ELISA和琼脂扩散试验检测抗体和5种毒素反应的特异性和敏感性。结果构建了重组融合毒素(命名为F5)Hc-VT1B-SEA-VT2B-SEB基因和重组表达载体F5-22b,且在表达宿主菌E.coliBL21中得到有效表达(9.90%),基因序列全长2937bp,编码成熟蛋白979个氨基酸,融合蛋白分子量112.369ku,测序结果与设计序列(GenBank)100%同源。表达产物经初步纯化后免疫獭兔获得抗五种毒素的血清抗体,且具有较高的特异性和敏感性。结论成功构建了融合毒素基因,获得了抗五种毒素的血清抗体,本实验结果为下一步建立食品广谱、快速免疫学检测新方法奠定了基础。

进口鱼粉中沙门菌监测与分析

为了解进口鱼粉中沙门菌的污染状况,给制定相关的检验检疫措施提供必要的理论依据,对2011年到2014年期间来自18个国家的543份鱼粉样品进行沙门菌检测。鱼粉样品经过增菌、沙门茵平板分离、VITEKⅡ生化试验和血清学鉴定后,共分离鉴定到27株沙门菌,分属于B、C、E 3个群。沙门茵的总检出率为4.97%,且来自不同国家的鱼粉阳性率不同。结果显示,进口鱼粉中存在着不同程度的沙门菌污染,应加强进口鱼粉的检疫和监管,减少沙门菌病的发生。

不同咸蛋腌制温度对禽流感毒灭活的影响

经人工接种H9亚型禽流感病毒(AIV)的鸭蛋,分别在12℃、22℃和32℃条件下按常规方法腌制于饱和盐水中,同时以置饱和盐水中的禽流感病毒和未经处理禽流感病毒样品作为对照,通过MDCK细胞培养、间接免疫荧光方法定期进行禽流感病毒毒力测定,结果在12℃、22℃和32℃条件下腌制鸭蛋中的禽流感病毒分别于49天、27天和4天失去毒力,置饱和盐水中的禽流感病毒分别在27天、9天和2天失去毒力,而未经处理的禽流感病毒分别在92天、29天和17天失去毒力;不同试验温度条件下,以荧光RT-PCR检测腌制鸭蛋和对照样品中的禽流感病毒,在100天后仍可检出病毒核酸(Ct<30)。以上检测结果表明,在腌制鸭蛋时于常温下置饱和盐水腌制40天以上的传统咸蛋生产工艺,可使禽流感病毒完全失去毒力,腌制的鲜咸蛋携带或传播禽流感病毒的风险极低或不存在风险。

食物中毒菌多联融合毒素F5基因的构建及结构分析

目的:构建食物中毒菌多联融合毒素基因并分析其是否保持了原来毒素基因的抗原特性。方法:采用一定的linker序列(G-P-G-P-G)将克隆的3种食物中毒菌5个毒素基因片段进行串联,构建重组融合毒素Hc-VT1B-SEA-VT2B-SEB(命名为F5)基因,应用DNAstar,对F5融合蛋白抗原特性等进行预测分析。结果:构建的融合毒素F5保留了5种毒素的抗原特性,基因全长序列2 937 bp,编码成熟蛋白979个氨基酸,测序结果与设计序列(GeneBank)100%同源。结论:成功构建了食物中毒菌多联融合毒素F5基因,为下一步研究融合毒素F5的表达及利用融合毒素检测食物中毒菌毒素建立广谱免疫学检测新方法奠定了基础。

人乙酰胆碱酯酶(hAchE)基因4个分泌型酵母表达载体的构建

设计合成3条引物,以载体pcDNA3.1-hAchE为模板,扩增出两端带有EcoRⅠ的约1.8 kb 去除信号肽但保留18 bp分子内伴侣序列的hAchE结构基因,及去除信号肽序列与分子内伴侣序列的hAchE成熟肽基因。将两个基因插入到酵母分泌型表达载体pPIC9和pHIL-S1,获得正向插入的4个分泌型酵母表达载体。为转化酵母,筛选分泌型高效表达hAchE菌株奠定了基础。

重组耐高温α-淀粉酶的分离纯化及其性质研究

基因工程菌所产生的重组耐高温α-淀粉酶，通过超滤浓缩、脱盐和聚丙烯酰胺凝胶电泳进行纯化，得到电泳纯的耐高温α-淀粉酶．并测得该酶的分子量为63KD，等电点pI（室温）为5．5，最适pH为6．0～6．5，稳定pH范围为4～11．5．耐高温α-淀粉酶的最适作用温度为90℃，95℃以上活力下降明显，100℃保温30min仍保留22％的酶活力；金属离子Cu^2＋、Fe^2＋、Fe^3＋、Zn^2＋及金属鏊合剂EDTA和柠檬酸盐离子对酶活有显著抑制作用，Mn^2＋、Mg^2＋有微弱的抑制作用，K^＋、Ca^2＋和表面活性剂SDS有微弱的激活作用，而其他一些离子如Na^＋、Li^＋则对酶活影响不大．

应用PCR技术快速检测熊蜂短膜虫

【目的】近年来,熊蜂作为温室作物的理想授粉者在国外已被广泛利用,并且获得很好的经济效益和生态效益,所以国外熊蜂经常被进口用于设施农业。熊蜂短膜虫Crithidia bombi是熊蜂的一种重要寄生虫病,一旦随进口熊蜂传入,将给国内熊蜂蜂群带来严重危害,因此迫切需要建立一种熊蜂短膜虫检测方法。【方法】基于熊蜂短膜虫基因内转录间隔区(internal transcribed space,ITS)基因序列设计了一对引物(Cri-F/R),建立了熊蜂短膜虫的PCR检测方法,并对退火温度、引物浓度和循环个数等反应条件进行了优化,同时验证了该PCR方法的灵敏性、特异性和稳定性。【结果】以熊蜂短膜虫ITS基因保守区设计特异性引物建立的熊蜂短膜虫PCR检测方法是可行的。优化的PCR反应条件为:退火温度59℃,引物浓度0.5μmol/L,扩增循环数35次。对感染熊蜂短膜虫的熊蜂总DNA的灵敏度达到13.24×10-5ng/μL,并具有良好的特异性和稳定性。将该方法应用于熊蜂短膜虫的检测,整个检测过程不超过4 h,具有良好的适用性。【结论】研究建立了熊蜂短膜虫检测方法,能用于疫情监测和进境熊蜂的检验检疫。

进境甲壳类水生动物风险分析

我国是一个渔业大国,也是一个水产养殖大国,有数以百万计的人以渔业和水产养殖为生,然而水生动物疾病给水产养殖行业造成的经济损失越来越巨大,每年我国因渔业病害带来的经济损失达100多亿元。近年来我国从境外引进水产苗种逐年增多,随之而来的是一些新的水生动物疫病开始传人我国,这些新的水生动物疫病来到了新的气候环境,面对新的养殖结构,摆脱了其在源发地的一些天然控制机制的束缚,呈现出暴发式的流行,给我国的养殖业带来巨大的经济损失。

鲍曼不动杆菌雏鸡分离株CCGGD201101的分离、鉴定及致病性研究

试验旨在鉴定吉林省某雏鸡孵育基地病死雏鸡组织中分离出的1株致病性菌CCGGD201101株并测定其致病性。对疑似致病菌进行生理生化试验、16SrDNA测序鉴定,并人工接种昆明鼠,测定其半数致死量,验证细菌毒力。经鉴定该菌为鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii)。以鲍曼不动杆菌CCGGD201101分离株为研究对象,并以鲍曼不动杆菌标准株(ATCC 19606)为对照,测得半数致死量,进一步证明鲍曼不动杆菌病死鸡分离株CCGGD201101具有较强致病性。

进境中国台湾养殖活鱼病害风险分析

本研究收集了关于中国台湾主要养殖活鱼病害的种类、发生与分布、易感染动物、对行业危害程度等方面的文献资料,并对其进行整理分析和风险评估,筛选出了从台湾进境养殖活鱼时应关注的检疫性病害名录。根据风险评估结果,提出了相应的降低风险的管理措施和检验检疫要求。