为定量检测NADC30-like谱系猪繁殖与呼吸综合征病毒(NADC30-like PRRSV),本研究针对NADC30 PRRSV株的ORF6基因保守区域设计1对特异性引物,通过优化反应条件,建立了一种灵敏度高、耗时短、操作简便且可量化的SYBR Green I荧光定量PCR检...为定量检测NADC30-like谱系猪繁殖与呼吸综合征病毒(NADC30-like PRRSV),本研究针对NADC30 PRRSV株的ORF6基因保守区域设计1对特异性引物,通过优化反应条件,建立了一种灵敏度高、耗时短、操作简便且可量化的SYBR Green I荧光定量PCR检测方法。建立的标准曲线结果显示:Ct值与质粒标准品浓度之间存在良好的线性关系,相关系数(R~2)为0.995。该方法特异性强,除对NADC30-like PRRSV有特异性扩增外,对猪圆环病毒2型(PCV2)、猪塞尼卡病毒(SVA)、牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、猪细小病毒(PPV)、经典型猪繁殖与呼吸综合征病毒(C-PRRSV)和NADC34-like PRRSV等病原均无扩增。对质粒标准品的检测下限可达4.62×10~1拷贝/μL,敏感性为常规PCR方法的100倍。组内变异系数与组间变异系数均小于1%,重复性较好。利用该方法与常规PCR方法同时检测53份血清样品,该方法的阳性检出率为11.3%(6/53),高于普通PCR的阳性检出率(9.4%,5/53),二者的总符合率为89.11%。本研究建立的SYBR Green I荧光定量PCR方法可以用于NADC30-like PRRSV的快速检测,为PRRS的防控提供技术支持。展开更多
目的利用原核表达系统表达塞尼卡病毒(Seneca Valley virus,SVV)VP1蛋白,并用纯化的蛋白免疫小鼠,制备VP1多克隆抗体。方法PCR扩增SVV VP1蛋白基因,并将其克隆至pET-28a(+)载体,构建pET-28a-VP1重组质粒。将重组质粒转化至BL21(DE3)pLyS...目的利用原核表达系统表达塞尼卡病毒(Seneca Valley virus,SVV)VP1蛋白,并用纯化的蛋白免疫小鼠,制备VP1多克隆抗体。方法PCR扩增SVV VP1蛋白基因,并将其克隆至pET-28a(+)载体,构建pET-28a-VP1重组质粒。将重组质粒转化至BL21(DE3)pLySs大肠埃希菌,使用IPTG诱导表达目的蛋白并优化表达条件,利用His标签镍离子蛋白纯化柱纯化蛋白。用纯化后的蛋白免疫小鼠,制备多克隆抗体,并用接毒后的BHK-21细胞进行Western blot验证。结果PCR扩增SVV VP1目的基因片段为792bp,与预期相符。成功构建pET-28a-VP1重组质粒,转化至DE3后经IPTG诱导表达相对分子质量单位约为35×10^3的目的蛋白,以37℃、0.8mmol/L诱导剂诱导4h表达量最高,且重组蛋白以包涵体形式表达。用His标签Ni^2+-NTA金属螯合蛋白质纯化柱纯化蛋白并免疫小鼠,制备的抗血清能与接毒后的BHK-21细胞裂解产生及纯化的VP1蛋白反应。结论原核表达了塞尼卡病毒VP1蛋白,制备了抗小鼠多克隆抗体,该抗体具有免疫反应性。展开更多
用纯化的塞尼卡病毒(Seneca Valley virus,SVV)VP1蛋白,辅以不同佐剂免疫小鼠,分别从体液免疫及细胞免疫对小鼠的免疫效果进行评估。结果表明,VP1-AL组与VP1-FCA组的特异性抗体一免后7 d均呈显著上升趋势,PBS组变化不明显。二免后14 d,V...用纯化的塞尼卡病毒(Seneca Valley virus,SVV)VP1蛋白,辅以不同佐剂免疫小鼠,分别从体液免疫及细胞免疫对小鼠的免疫效果进行评估。结果表明,VP1-AL组与VP1-FCA组的特异性抗体一免后7 d均呈显著上升趋势,PBS组变化不明显。二免后14 d,VP1-FCA组特异性抗体效价达到最高值(1∶163840),PBS组抗体效价是1∶16(P<0.01);VP1-AL组特异性抗体效价达到最高值(1∶5120),PBS组抗体效价是1∶16(P<0.01)。中和抗体效价,二免后7 d VP1-FCA组达到最高值(1∶512),PBS组抗体效价是1∶8(P<0.01);二免后14 d VP1-AL组达到最高值(1∶1024),PBS组抗体效价是1∶16(P<0.01)。小鼠T淋巴细胞亚群CD3^(+)CD4^(+)与CD3^(+)CD8^(+)在二免后VP1-FCA组显著升高(P<0.05),VP1-AL组极显著升高(P<0.01)。淋巴细胞增殖试验表明各试验组均显著升高(P<0.05)。对免疫小鼠血清中细胞因子检测结果表明,IL-4的分泌显著提高(P<0.05),IL-2与IFN-γ变化不明显。本研究利用SVV VP1重组蛋白联合佐剂,VP1-AL组是有前景的候选疫苗,可诱导小鼠体内产生免疫应答且效果良好,为SVV疫苗猪体免疫研究奠定理论基础。展开更多
文摘为定量检测NADC30-like谱系猪繁殖与呼吸综合征病毒(NADC30-like PRRSV),本研究针对NADC30 PRRSV株的ORF6基因保守区域设计1对特异性引物,通过优化反应条件,建立了一种灵敏度高、耗时短、操作简便且可量化的SYBR Green I荧光定量PCR检测方法。建立的标准曲线结果显示:Ct值与质粒标准品浓度之间存在良好的线性关系,相关系数(R~2)为0.995。该方法特异性强,除对NADC30-like PRRSV有特异性扩增外,对猪圆环病毒2型(PCV2)、猪塞尼卡病毒(SVA)、牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、猪细小病毒(PPV)、经典型猪繁殖与呼吸综合征病毒(C-PRRSV)和NADC34-like PRRSV等病原均无扩增。对质粒标准品的检测下限可达4.62×10~1拷贝/μL,敏感性为常规PCR方法的100倍。组内变异系数与组间变异系数均小于1%,重复性较好。利用该方法与常规PCR方法同时检测53份血清样品,该方法的阳性检出率为11.3%(6/53),高于普通PCR的阳性检出率(9.4%,5/53),二者的总符合率为89.11%。本研究建立的SYBR Green I荧光定量PCR方法可以用于NADC30-like PRRSV的快速检测,为PRRS的防控提供技术支持。
文摘用纯化的塞尼卡病毒(Seneca Valley virus,SVV)VP1蛋白,辅以不同佐剂免疫小鼠,分别从体液免疫及细胞免疫对小鼠的免疫效果进行评估。结果表明,VP1-AL组与VP1-FCA组的特异性抗体一免后7 d均呈显著上升趋势,PBS组变化不明显。二免后14 d,VP1-FCA组特异性抗体效价达到最高值(1∶163840),PBS组抗体效价是1∶16(P<0.01);VP1-AL组特异性抗体效价达到最高值(1∶5120),PBS组抗体效价是1∶16(P<0.01)。中和抗体效价,二免后7 d VP1-FCA组达到最高值(1∶512),PBS组抗体效价是1∶8(P<0.01);二免后14 d VP1-AL组达到最高值(1∶1024),PBS组抗体效价是1∶16(P<0.01)。小鼠T淋巴细胞亚群CD3^(+)CD4^(+)与CD3^(+)CD8^(+)在二免后VP1-FCA组显著升高(P<0.05),VP1-AL组极显著升高(P<0.01)。淋巴细胞增殖试验表明各试验组均显著升高(P<0.05)。对免疫小鼠血清中细胞因子检测结果表明,IL-4的分泌显著提高(P<0.05),IL-2与IFN-γ变化不明显。本研究利用SVV VP1重组蛋白联合佐剂,VP1-AL组是有前景的候选疫苗,可诱导小鼠体内产生免疫应答且效果良好,为SVV疫苗猪体免疫研究奠定理论基础。