TG-ROC分析方法在检测试剂质量评价中的应用

目的比较人类T淋巴细胞白血病病毒(HTLV)ELISA检测试剂和Western Blot(简称WB)确认试剂的关系,分析HTLV检测试剂的质量水平。方法通过WB确认试剂对156份ELISA初筛阳性的人血清标本进行HTLV抗体的检测,使用TG-ROC分析方法来选出ELISA最佳CO值(阈值),以2×2列联表分析这两种检测结果的一致性,并用McNemar检验评估检测结果的一致性,综合评价HTLV检测试剂质量水平。结果 156份ELISA初筛阳性的人血清标本经过WB进行确证后仅有40份为阳性,其余116份为阴性。TG-ROC分析结果得出该ELISA检测试剂的敏感性和特异性分别为97.5%和45.7%,McNemar检验也表明ELISA与WB检测结果差异有统计学意义(P<0.05)。通过调整阈值,能使ELISA敏感性和特异性同时达到88.8%(参数法)。比较参数法和非参数法,得到曲线下面积为0.923 5(参数法),两者的结论基本一致。结论虽然该ELISA试剂结果与WB结果有差别,但是通过调整阈值,可以提高其敏感性和特异性,继而增加诊断结果的可靠性。

2020年国产口服轮状病毒活疫苗质量一致性研究

目的:评价口服轮状病毒疫苗(Oral Rotavirus Vaccine,ORV)的质量一致性,提升该疫苗的安全性和有效性,保证婴幼儿用药安全。方法:对2020年国产ORV的关键控制指标(病毒滴度)的检验结果进行趋势分析,并与其前一年结果进行比较;将中国食品药品检定研究院(简称中检院)检测结果与企业结果进行比较。结果:2020年度该疫苗病毒滴度趋势分析结果显示未见超趋势(Out of Trend,OOT)。2020年度和2019年度比较结果显示企业年度间具有较好的一致性。中检院与企业病毒滴度检测结果比较差异均无统计学意义(P=0.3263,P>0.05);Bland-Altman法统计显示,97.7%批次的检测结果在不同浓度范围内的差值位于2倍标准差(2SD)以内。结论:2020年国产口服轮状病毒活疫苗质量稳定、可控,具有良好的一致性。今后应加强趋势分析中对OOT结果的调查、反馈,加强年度间比较分析,以及中检院与企业不同实验室间的比对研究。

1株人感染柯萨奇病毒A组16型B1b亚型的分离和鉴定

柯萨奇病毒A16(CV-A16)是小RNA病毒科肠道病毒属的成员,是引起婴幼儿手足口病(HFMD)的常见病原体之一[1]。CV-A16是含有约7.4 kb基因组的正义单链RNA病毒,其基因组包含5′端非翻译区(5′UTR)、结构蛋白编码区P1、非结构蛋白编码区P2/P3及3′非翻译区(3′UTR)。P1编码4种结构蛋白(VP1、VP2、VP3、VP4),P2和P3分别编码7种非结构蛋白(2A、2B、2C、3A、3B、3C、3D)[2]。随着研究的不断深入,在分子流行病学方面,基于VP1基因的完整序列,CV-A16可以在系统发育上分为A、B、C和D 4个基因组[3-6]。

河南汉族人群HLA超型的分析研究

目的分析河南汉族人群HLA基因多态性和超型分布。方法采用测序法对111名志愿者的血样进行HLA-A、-B、-C、-DRB1和-DQB1五个座位的基因分型,分别根据5个研究组的HLA超型分型标准进行HLAⅠ类和Ⅱ类超型的分析统计。结果总共检测出130个HLA等位基因,其中HLA-A座位为21个等位基因,-B座位为41个,-C座位为24个,-DRB1座位为27个,-DQB1座位为17个。依据不同的分型方法,共得到86个超型,其中HLAⅠ类51种,Ⅱ类35种。按照5个研究组的分型标准,HLAⅠ类的优势超型型别基本相似,其中HLA-A2和-B7的分布差异无统计学意义(P>0.05)。但对于HLAⅡ类分子,超型名称分类标准在不同的研究组均不同。结论获得河南汉族人群的超型分布特征,HLAⅠ类分子的优势超型为HLA-A3、-A2、-B7、-B44和-B62,但HLAⅡ类分子的超型分类标准尚不统一,有待进一步研究。

轮状病毒疫苗中猪圆环病毒的污染情况

轮状病毒是全球引起婴幼儿急性胃肠炎的最主要病原体,目前尚无有效的治疗药物,而疫苗是预防轮状病毒感染最经济有效的手段。在疫苗的质量控制中,外源因子是重要的检测指标。在2010年,葛兰素史克和默克世界两大疫苗生产厂商所生产的Rotarix誖和RotaTeq誖中,均检出有外源因子———猪圆环病毒。这是继肠套叠事件之后,轮状病毒疫苗的安全性问题再度成为卫生领域关注的焦点。本文介绍了猪圆环病毒的基本情况以及当前的研究进展、污染事件的始末和各方的应对措施,并简要分析该事件处理中的经验教训。

诺如病毒VP1蛋白病毒样颗粒在毕赤酵母中的分泌表达

目的探讨诺如病毒(Norovirus,NoV)VP1蛋白的病毒样颗粒(virus-like particle,VLP)在毕赤酵母表达系统中分泌表达的可行性。方法用pPICZa-A表达载体和X-33毕赤酵母株进行NoV GⅡ.4和GⅡ.17型VP1蛋白的分泌表达,并对阳性菌株进行Mut表型筛选。同时优化起始pH(5.0、6.0、7.0、8.0)、甲醇终浓度(0.5%、1.0%、1.5%、2.0%)及发酵时间(24、48、72、96、120 h)3个表达条件。取原始及传代10代菌株,采用优化条件进行发酵,于诱导0~60 h间,通过双标准曲线实时荧光定量PCR法测定外源基因拷贝数。发酵产物经蔗糖密度梯度离心纯化后,检测其浓度及纯度,并观察VLP的形态。结果表达目的蛋白的重组酵母菌株均为Mut+型。最佳发酵pH为7.0,甲醇终浓度为1%,发酵时间为72 h。菌株传代后未发生基因缺失,整合基因在10代内稳定性良好。GⅡ.4及GⅡ.17型VP1纯度均约85%,浓度分别为133和165μg/mL,VP1蛋白均可自发组装成直径约40 nm的VLP颗粒,形态与天然病毒相似。结论用毕赤酵母表达系统进行NoV VP1蛋白VLP分泌表达是可行的。

进口轮状病毒疫苗RotaTeq的热稳定性

目的分析进口轮状病毒(rotavirus,RV)疫苗RotaTeq(RV5)的热稳定性。方法采用荧光定量PCR法分别测定22~25和37℃条件下放置不同时间的RV5疫苗滴度,以参考疫苗株滴度为标准,计算RV5疫苗5个型别毒株(G1、G2、G3、G4、P1)滴度和总滴度。同时扩增RV5疫苗G3型毒株的VP7序列,并与GenBank中登录的原型病毒株r G3的VP7序列进行比较。结果22~25℃条件下,G1、G2、G3、G4、P1型毒株滴度和总滴度每天下降速度分别为3.51%、2.26%、3.19%、5.22%、3.18%和3.61%,各型别毒株间差异无统计学意义(P>0.05);37℃条件下,G3型毒株滴度的下降速度(31.20%/h)明显高于其他型别毒株(G1、G2、G4、P1下降速度分别为每小时0.75%、0.31%、1.08%和2.07%),差异有统计学意义(P<0.05)。G3型毒株滴度于37℃的半衰期仅为0.07 d,其原型株rG3的半衰期可达2.10 d。RV5疫苗G3型疫苗株与其原型株的差异包括散在的氨基酸差异(F32L、T69A、L83F、I118T、D151G、P275L)及位于5′UTR(T25C)和3′UTR(G1041A、A1045G、G1046A、G1047A、C1048T、A1053T)较聚集的核苷酸差异。结论RV5疫苗中各型别毒株在22~25℃时热稳定性良好,但在37℃时G3型疫苗株是影响RV5疫苗热稳定性的关键,位于VP7 UTR的核苷酸突变可能是导致其热稳定性降低的主要原因。

脊髓灰质炎减毒活疫苗对轮状病毒减毒活疫苗的免疫原性的影响研究

目的评价同时接种脊髓灰质炎减毒活疫苗是否会影响轮状病毒减毒活疫苗的免疫原性。方法以葛兰素史克公司生产的Rotarix作为研究对象,将接种人群随机分为两组。均在第0天、第1个月口服接种两剂Rotarix,并根据国家规划接种计划在第0天、第1个月和第2个月口服接种脊髓灰质炎减毒活疫苗(OPV)。Rotarix和OPV在不同天接种为间隔接种组,Rotarix和OPV在同一天接种为同时接种组。分别在第0天、第2个月、第12个月采集血清,用酶联免疫吸附法测定血清RV-IgA。通过统计分析两组的RV-IgA血清阳转率和水平分布是否有统计学差异。结果间隔接种和同时接种组的第2个月血清RV-IgA阳转率分别为73.84%和63.95%,差异有统计学意义(P<0.05);两组的免疫后RV-lgA抗体几何平均浓度(GMC)分别为97 EU/ml和90 EU/ml,差异无统计学意义(P>0.05)。与同时接种组相比,间隔接种组第12个月的血清RV-IgA阳转率和GMC均较高,差异有统计学意义(P<0.05).结论同时接种脊髓灰质炎减毒活疫苗会影响轮状病毒减毒活疫苗的免疫应答,尤其是RV-IgA抗体水平的维持。

口服Ⅰ型Ⅲ型脊髓灰质炎减毒活疫苗的稳定性

目的考察口服Ⅰ型Ⅲ型脊髓灰质炎减毒活疫苗在不同温度和pH环境下的稳定性。方法将6批疫苗分别于2~8℃放置6个月、22~25℃放置7 d、37℃放置7 d、-20℃放置27、30、33个月,或反复冻融5次;将疫苗pH调至3.0~10.0。采用细胞培养半数感染量(cell culture infective dose 50%,CCID50)法检测病毒总滴度及分型滴度。结果口服二价脊髓灰质炎减毒活疫苗在2~8℃保存6个月,22~25℃保存5 d,37℃保存2 d,反复冻融5次,-20℃保存27个月,pH 3.0~10.0环境下,疫苗效力均符合质量标准。结论疫苗的保存温度及时间对其稳定性均有影响。

2019年国产口服轮状病毒活疫苗质量控制中病毒滴度趋势分析

目的对口服轮状病毒活疫苗(oral rotavirus vaccine, ORV)质量控制中的病毒滴度进行趋势分析。方法利用CCID50+ELISA检测国内企业2019年生产的ORV的关键控制指标(病毒滴度),根据检测结果计算均值,建立警戒限(均值■和行动限(均值■,绘制趋势分析图,进行连续性和周期性趋势分析;并将中国食品药品检定研究院(National Institutes for Food and Drug Control, NIFDC)病毒滴度结果与企业病毒滴度结果进行比较。结果病毒滴度趋势分析显示NIFDC检测结果未见超趋势(out of trend, OOT),企业检测结果有1次连续10批以上结果高于平均值,经偏差调查证实生产、质控和检测环节均未发现异常情况,分析原因可能是其中有多批成品来自同一批原液。2019年度和2018年度比较结果显示年度间具有较好的一致性。NIFDC与企业病毒滴度结果显示均检测结果差异没有统计学意义(P=0.082 7,P>0.05);Bland-Altman法统计显示97%批次的检测结果的差值位于2倍标准差(2s)以内。结论对2019年国产ORV病毒滴度的趋势分析反映出该制品的批间一致性以及生产工艺的稳定性良好。

非洲绿猴肾细胞中猪圆环病毒1型的检测

目的建立轮状病毒疫苗污染事件中的外源因子猪圆环病毒1型（porcine circovirus type1，PCV1）感染非洲绿猴肾细胞（Vero细胞）的检测方法。方法培养感染PCV1的Vero细胞6d后，通过定性PCR、定量PCR、电子显微镜（电镜）检查和原位杂交检测PCV1的复制与增殖。结果从感染PCV1的Vero细胞培养物提取的DNA，其PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳可见特异性条带；定量PCR检测显示，感染6d后病毒总拷贝数是感染前的794．3倍；定性和定量PCR的最低检出浓度均为10^2.0拷贝／ml；电镜观察到PCV1特征性形态病毒颗粒；原位杂交检测到出现深色阳性信号的PCV1阳性细胞。结论PCV1感染Vero细胞后的复制增殖可以通过上述方法进行检测。

筛选诱导肠道病毒71型特异性免疫应答的最短氨基酸基序

目的筛选肠道病毒71型(EV71)中和表位,确定诱导机体免疫应答的特定最短氨基酸基序,为合成肽疫苗研发提供理论依据。方法利用噬菌体随机十二肽库淘选EV71中和抗体特异性结合克隆并测序,推导出中和表位的关键序列。合成含有关键序列且N端乙酰化(AC)和C端连接血蓝蛋白(KLH)的系列肽段,免疫小鼠后收集血清,经Western blot、ELISA和中和试验验证肽段的免疫原性以及免疫后血清的中和活性。结果经过3轮淘选和克隆测序后,分析确定关键基序为KQEKDL。Western blot结果表明修饰后的含关键基序的系列肽段免疫小鼠获得的血清与EV71和VP1蛋白均有不同程度结合。ELISA结果表明仅含有最短关键基序的合成肽段(AC-KQEKDL-KLH)免疫后血清对其余3条肽段及EV71的反应最强。中和试验结果表明该肽段免疫后血清的中和效价也最高。结论利用噬菌体随机肽库技术成功筛选出EV71中和表位,确定KQEKDL关键基序可能是诱导机体免疫应答的特定最短氨基酸序列,为了解免疫应答机制、免疫原性评价及多肽疫苗的研发提供理论依据。