促炎分子盘状结构域受体2在泛素化修饰过程中与泛素分子的偶联方式

目的研究泛素分子中哪些位点的赖氨酸(Lys)残基参与了具有促炎效应的膜受体盘状结构域受体2(DDR2)的多聚泛素化修饰。方法将DDR2、Cbl-b及泛素分子不同位点Lys的突变体共转染HEK293T细胞,以胶原蛋白刺激细胞诱导DDR2发生活化。利用免疫沉淀方法分离细胞中的DDR2,Western blot法检测DDR2与不同泛素分子的偶联情况。结果仅保留27位Lys的泛素分子偶联到DDR2分子上的能力与野生型泛素分子相接近,保留33位Lys的泛素分子有较微弱与DDR2偶联的能力。27位Lys突变可使泛素分子彻底丧失与DDR2相偶联的能力,而33位Lys突变使得泛素分子偶联DDR2的能力部分丧失。结论 Cbl-b介导的DDR2的多泛素化修饰主要是通过泛素分子的Lys27偶联的,Lys33可能也部分参与了DDR2的泛素化修饰。

生物化学与分子生物学实验教学探讨

针对生物化学与分子生物学的实验教学中遇到的问题，分别从调动学生积极性、实验安排、实验内容等方面，提出了几点建议，对实验课的考核及课后总结提出了设想，初步探讨医学院校实验教学改革的新思路。

盘状结构域受体2与EGFP融合载体的构建及细胞中的活性分析

目的:寻找使盘状结构域受体2(DDR2)在细胞内的表达情况易于检测并能动态追踪其蛋白表达分布的途径方法:采用PCR技术扩增获得DDR2编码区无终止码序列通过限制性酶切将DDR2片段亚克隆入pEGFP-N3载体中,转染293T细胞后通过倒置显微镜观察绿色荧光蛋白的表达,并用免疫印迹技术检测融合载体的表达及胶原刺激后活化状况.结果:成功构建了DDR2/EGFP融合表达载体,进一步的分析也证明此融合表达载体能在细胞中正确表达并可以被配体所激活.结论:DDR2/EGFP的成功构建及可进一步检测磷酸化,为深入研究DDR2的功能奠定了基础.

抽象概念不应成为基础医学教育的障碍

以分子生物学教学方法为例,针对医学知识的抽象和枯燥、医学院校本科生学习热情不高等现状,提出在理论学习之前介绍基本理论的实践应用价值;通过生动的比喻使抽象概念具体化;加强介绍重要理论和概念出现的过程的方法。上述方法有利于激发学生的学习兴趣,培养学生科学的思维方式。

DDR2/Fc融合基因真核表达载体的构建及表达

目的:构建DDR2/Fc真核表达载体,使其在HEK293细胞中进行表达.方法:采用PCR技术,分别从大鼠脑组织、含人IgG1Fc全长互补DNA(cDNA)的质粒中扩增出盘状结构域受体2(DDR2)的DS区域、Fc段,以定向克隆的方法将其串联至真核表达载体pcDNA3.1(-)中,获得重组表达载体DDR2/Fc-pcDNA3.1(-);采用脂质体转染技术转染HEK293细胞;RT-PCR、免疫印迹检测融和蛋白的表达.结果:DNA测序和限制型酶切鉴定证明两段基因正确克隆至pcDNA3.1(-)的多克隆位点,细胞裂解物中检测到融合蛋白的表达,其分子质量与预期大小一致,该融合蛋白能正确表达于HEK293细胞中.结论:成功构建了DDR2/Fc融和表达载体,表达了融合蛋白.

人NDRG2启动子的克隆与活性鉴定

目的:克隆人NDRG2的启动子,并进行启动子的活性鉴定。方法:用Advantage-GC Taq酶,采用PCR方法,以BCA克隆R-998D1为模板,克隆人NDRG2(-1455/+274)的启动子。分别构建NDRG2(-1131/+274)、NDRG2(-273/+274)、NDRG2(-135/+274)、NDRG2(-79/+274)和NDRG2(-79/+57)等不同长度的截短体,并分别亚克隆入pGL3-basic报告基因载体,测序鉴定。分别转染HEK293和HeLa细胞后,运用双荧光报告基因系统进行启动子活性分析,从而判断核心启动子的位置。结果:人NDRG2的启动子克隆成功,并构建了不同长度的截短体,DNA测序结果与报道一致。报告基因分析结果将人NDRG2启动子的核心区域定位于NDRG2(-79/+57)。结论:随着人NDRG2的启动子的长度逐渐被截短,启动子的基础活性也逐渐降低,可将人NDRG2启动子的核心区域定位于NDRG2(-79/+57)。

信息化手段在医学本科基础课教学中的应用

针对医学本科基础课知识较为抽象、本科生存在学习方法不合理、学习热情不高涨等问题,在教学中应合理利用信息化手段,充分利用网站资源和网络共享空间建立网络教学系统,加强以学生为主体的课堂讨论,激发学生的学习兴趣,培养学生科学的学习和思考方法。

SPARC通过竞争性结合胶原蛋白抑制DDR2的活化

目的探讨富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白(SPARC)是否与盘状结构域受体2(DDR2)竞争性结合胶原蛋白,并观察SPARC对DDR2磷酸化水平的影响。方法采用转染小干扰RNA的方法下调人前列腺癌细胞PC-3中DDR2的表达,观察对该细胞中SPARC mRNA表达水平的影响。在HEK293T细胞中同时过表达SPARC和DDR2,在有无胶原蛋白刺激的情况下,通过免疫沉淀及Western blot法检测DDR2磷酸化水平的变化。结果下调DDR2会引起SPARC mRNA和蛋白表达水平显著下降;而SPARC能够抑制胶原蛋白刺激的DDR2磷酸化。结论 SPARC很可能通过竞争性结合胶原蛋白来抑制DDR2的活化。

GFR/DDR2嵌和受体的构建和稳定表达的鉴定

目的 :将一在细胞膜表面不表达或低表达的受体胞外区与盘状结构域受体 2 (DDR2 )的胞内区融合 ,构建一嵌和DDR2受体 ,避免在活化此受体的同时激活与DDR2有相同配体的受体介导的信号通路 ,为探索DDR2介导的胞内信号途径奠定基础 .方法 :采用PCR扩增和限制性酶切的方式 ,将表皮生长因子受体 (EGFR)的胞外区与DDR2的跨膜及胞内区进行融合并稳定转染EGFR低表达的 2 93细胞 ,G4 1 8筛选 ,流式细胞仪检测嵌和受体在膜表面的表达状况 .结果 :成功构建了EGFR/DDR2嵌和表达载体 ;筛选到稳定表达此嵌和受体的 2 93细胞株 .结论 :融合并稳定表达了EGFR/DDR2嵌和受体 .

人p65和IκBα基因真核表达载体的构建及在永生化滑膜细胞中的表达

目的构建人p65和IκBα基因的真核表达载体并检测其在人永生化滑膜细胞MH7a中的表达.方法应用RT-PCR方法从体外培养的HEK293细胞mRNA中扩增出p65和IκBα基因的编码区,克隆至pMD18T载体并测序,然后亚克隆至真核表达载体pcDNA3.1myc/His(-)A,酶切鉴定正确后以脂质体法瞬时转染MH7a细胞,WesternBlot检测p65和IκBα的表达.结果测序证实PCR扩增得到的p65和IκBα基因编码区序列正确;脂质体法转染MH7a细胞后检测到预期目的蛋白的表达.结论成功构建了p65和IκBα的真核表达载体并使其在人永生化滑膜细胞中表达.

E3泛素连接酶Cbl-b对白细胞介素1诱导细胞效应的负调控作用

本研究旨在探讨E3泛素连接酶Cbl-b对滑膜细胞中白细胞介素1(interleukin-1,IL-1)信号通路的影响。采用Western blot方法检测Cbl-b基因缺失小鼠滑膜细胞中Cbl-b及IL-1诱导的基质金属蛋白酶13(matrix metalloproteinase 13,MMP-13)的表达水平。胶原底物与滑膜细胞培养上清进行共孵育后通过SDS-PAGE分析胶原的降解情况。结果显示,与野生型相比,Cbl-b基因敲除的小鼠滑膜细胞在IL-1刺激条件下表达更多的MMP-13,且培养上清具有更强的降解胶原的能力。这些结果提示,Cbl-b对IL-1诱导的细胞效应具有负调控作用。

一种乳酸菌-金属有机框架复合物用于强化肿瘤乏氧光动力和免疫治疗

开发长期有效的癌症治疗技术仍然是科研工作者和临床医生面临的重要任务.厌氧型乳酸菌(LAB)具有天然的乏氧倾向性,可自发富集在缺氧的肿瘤微环境中.金属有机框架(MOF)是一类独特的纳米材料,其中的ZIF-67可以自发分解过氧化氢产氧,且析氧能力可被光照增强.然而,LAB或MOF单独应用于肿瘤治疗的效果并不令人满意.在本文中,我们制备了一种MOF修饰的乳酸菌制剂,用以在缺氧性肿瘤中局部产生活性氧(ROS)助力光动力治疗,同时精准诱导宿主肿瘤免疫.这些细菌表面被ZIF-67纳米材料修饰(LAB@ZIF-67),经体内循环后富集在肿瘤微环境中.细菌表面的ZIF-67可以被CT-26细胞吸收,并且在光照后检测到细胞内快速生成ROS.体内实验表明,该细菌复合物可通过光动力疗法消灭肿瘤,同时诱导肿瘤特异的炎性反应,招募巨噬细胞和T细胞实现肿瘤的免疫治疗.此类材料-细菌复合物为今后研发肿瘤主动靶向药物和癌症免疫疗法提供了新思路.