Co-IP联合质谱分析筛选中华蜜蜂气味受体OR1和OR2的互作蛋白

【目的】中华蜜蜂(Apis cerana cerana)是我国特有的蜜蜂品种,其高度灵敏的嗅觉系统能在复杂气味环境中识别群体内化学信号以及区分食物源散发的特异性气味分子,气味受体(Odorant receptors,ORs)在中蜂识别气味分子的行为过程中起到了重要而又关键的作用。通过分析筛选OR1和OR2的互作蛋白,为深入探究OR1和OR2蛋白在蜜蜂嗅觉系统中的功能提供理论依据。【方法】通过构建OR1和OR2基因的真核表达载体pFastBac-OR1和pFastBac-OR2载体,转染Sf9细胞,提取细胞总蛋白,利用免疫共沉淀(Co-IP)联合质谱分析技术筛选鉴定与OR1和OR2互作的细胞蛋白,并对这些互作蛋白进行GO功能注释、KEGG信号通路和蛋白互作网络分析。【结果】IP组和IgG组重组蛋白在细胞内得到正确表达,利用Co-IP联合质谱分析技术共筛选到273个与OR1互作的细胞蛋白和204个与OR2互作的细胞蛋白,主要为微管蛋白、热休克蛋白、核糖体蛋白等。对这些蛋白进行GO功能富积分析,发现这些蛋白质涉及多种生物学功能,包括RNA剪接、核糖体和能量运输有关。KEGG信号通路分析结果表明互作蛋白参与调节了多条细胞内的重要通路,包括核糖体、剪接体、RNA转运等与核糖体相关的通路,丙酮酸代谢、硫胺素新陈代谢、脂肪酸生物合成、淀粉和蔗糖代谢、FoxO信号通路,Hedgehog信号通路等。【结论】OR1和OR2可能通过与多种蛋白直接或间接的相互作用调控并影响其嗅觉感受。

中华蜜蜂Smoothened基因的鉴定、表达及生物信息学分析

旨在明确中华蜜蜂Smoothened基因(AcerSmo)的序列特征及表达特性,为进一步研究其在蜜蜂体内的功能奠定理论基础,对中华蜜蜂AcerSmo基因DNA序列进行扩增鉴定,运用多种生物信息学软件对其进行结构和功能分析,并采用RT-qRCR对中华蜜蜂不同组织和发育时期的表达特性进行检测。序列分析结果表明,基因cDNA全长3 495 bp(GenBank登录号:OP616035),其中开放阅读框(ORF)区域2 952 bp,共编码936个氨基酸。该蛋白理论分子质量为111.15 ku,理论等电点为8.82,属于不稳定的两性蛋白。该蛋白N-末端有一段含21个氨基酸的信号肽,有6个跨膜结构域,亚细胞定位主要在内质网和细胞核。该蛋白二级结构和三级结构以无规则卷曲(50.76%)为主,其次为α-螺旋(25.33%),从昆虫到哺乳动物,AcerSmo蛋白序列高度保守;荧光定量PCR结果表明,AcerSmo在30日龄中华蜜蜂不同组织中均存在表达,而在触角与头的表达量显著高于其他组织,在中华蜜蜂触角与头组织中,5日龄时AcerSmo的mRNA表达量最高。AcerSmo蛋白具有Smoothened蛋白的保守结构,且在触角中呈高丰度表达,推测AcerSmo基因可能在蜜蜂的嗅觉识别过程发挥着重要作用。

意大利蜜蜂防御素-2蛋白序列分析及表达特性研究

【目的】对意大利蜜蜂(Apis mellifera)防御素-2蛋白(Defensin-2,Def-2)进行蛋白序列分析和表达特性研究,以期为意大利蜜蜂防御素基因的免疫防御机制、发育和代谢途径研究提供理论基础。【方法】利用生物信息学在线网站及软件对Def-2蛋白进行预测分析,并采用实时荧光定量PCR对意大利蜜蜂不同发育时期(幼虫期、蛹期及1、5、10、15、20、25和30 d成年期工蜂)的基因相对表达量进行检测分析。【结果】意大利蜜蜂防御素-2基因(Def-2)编码104个氨基酸残基,相对分子量为11858.90 Da,理论等电点(pI)为8.54,为两性不稳定蛋白。该蛋白N-末端有一段含21个氨基酸的信号肽,存在1个跨膜结构域,亚细胞主要定位于内质网、液泡和高尔基体,无糖基化位点,存在15个磷酸化位点,其二级结构以无规卷曲(54.81%)为主、延伸链(28.85%)分布较多,α-螺旋(16.35%)分布较少,蛋白序列高度保守,与Def-1、GB44032-PA、Dl-2、Imd等蛋白存在基因互作关系,具有防御蛋白样结构域(DEFL),结构域采用以半胱氨酸稳定的α/β支架为特征的结构,亲缘关系与小蜜蜂极为相近。Def-2基因在意大利蜜蜂不同发育时期的表达水平存在差异且随日龄增大而升高,30 d的相对表达量显著高于其他日龄(P<0.05)。【结论】意大利蜜蜂Def-2蛋白属于两性不稳定蛋白,参与细胞间信号传输并维持细胞正常形态;蛋白序列高度保守,亲缘关系与小蜜蜂最近,且该基因在30 d成年期工蜂中高丰度表达,推测其可能调节免疫基因转运而影响蜜蜂的免疫识别过程。

意大利蜜蜂Ci蛋白的生物信息学分析

【目的】掌握意大利蜜蜂转录因子(Ci)的生物信息学并阐述其功能,为揭示Ci蛋白在意大利蜜蜂Hh信号通路中的功能和作用打下基础。【方法】从NCBI获取意大利蜜蜂Ci蛋白氨基酸序列,分别使用ProtParam预测其理化性质、SignalP-5.0预测信号肽、TMHMM-2.0预测跨膜结构,通过NetOGlyc 3.0、NetNGlyc 1.0、NetPhos 3.1、SUMOplot等进行O-糖基化位点、N-糖基化位点、磷酸化位点及苏木化位点预测,采用GOR4、SWISS-MODEL、CD-Search等预测意大利蜜蜂Ci蛋白高级结构,在多重序列比对分析的基础上利用MEGA 11.0构建系统发育进化树,并通过String数据库预测相互作用蛋白。【结果】意大利蜜蜂Ci蛋白存在2个亚型,分别是XP_624136.4和XP_006558245.2。其中,XP_624136.4亚型的开放阅读(ORF)为4338 bp,编码1445个氨基酸残基,编码蛋白分子量为15.50 kD,理论等电点(pI)为8.39;XP_006558245.2亚型的ORF为3873 bp,编码1290个氨基酸残基,编码蛋白分子量13.99 kD,pI为8.48。2个亚型均属于不稳定的两性蛋白,无信号肽,无跨膜结构,主要定位于在细胞核,少数分布在囊细胞质,XP_006558245.2亚型在线粒体中也有少量分布。XP_624136.4亚型存在2个O-糖基化位点、9个N-糖基化位点、174个磷酸化位点及5个苏木素化位点;XP_006558245.2亚型存在26个O-糖基化位点、8个N-糖基化位点、156个磷酸化位点及5个苏木素化位点。意大利蜜蜂Ci蛋白二级结构主要有α-螺旋、延伸链和无规则卷曲,其三级结构中无规则卷曲、延伸链分布较多,α-螺旋分布较少;2个亚型均具有5个典型的C_(2)H_(2)型锌指蛋白结构域,且从昆虫到哺乳动物Ci蛋白序列高度保守。意大利蜜蜂Ci蛋白与Kinesin-B、Ptc、Poz、Su(fu)、Slmb、Smo、Csnk1a1、Cul-3和Fu等驱动蛋白样蛋白形成相互作用网络。【结论】意大利蜜蜂Ci蛋白属于不稳定的两性蛋白,主要定位于细胞核中,少量分布在囊细胞质或线粒体中,具有5个典型的C2H2型锌指蛋白结构域,蛋白序列高度保守,在意大利蜜蜂Hh信号通路中主要承担转录功能,对意大利蜜蜂的生长发育、跨膜运输、突触传递、信号转导及蛋白生成等起重要调控作用。

老有颐养灿夕阳同心润泽惠万家--访大连圣泽天下网络科技有限公司总经理金成学

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