陆地棉TRM基因家族的鉴定及纤维品质相关优异单倍型分析

【目的】鉴定陆地棉TRM基因家族序列及理化性质,分析与棉纤维品质相关的优异单倍型基因差异。【方法】利用生物信息学分析陆地棉TRM基因家族进化关系、理化性质和聚类表达;利用基因单倍型效应分析筛选调控纤维品质性状(纤维长度、比强度、马克隆值)的候选基因。【结果】陆地棉TRM基因家族编码的氨基酸为376~1093,等电点为4.64~9.56。亚细胞定位预测发现多达60个陆地棉TRM基因家族定位于细胞核中。TRM基因家族含有较多的光响应、激素响应、胁迫响应和生长发育相关的元件。60个TRM基因家族在纤维发育时期优势表达,调控棉花纤维发育。每个基因的单倍型个数为1~8,并筛选到纤维长度、强度以及马克隆值相关的优异单倍型TRM基因分别有14、18和15个,其中有11个基因同时具有长度、强度、马克隆值3种改良纤维品质的优异单倍型。GH_D09G0775的Hap_4单倍型和GH_D03G1434的Hap_3单倍型在增加纤维长度、强度的同时降低了马克隆值。【结论】在陆地棉(Gossypium hirsutum L.)中鉴定出75个TRM基因家族成员分布在24条染色体上,系统进化将其分为ClusterⅠ~Ⅲ3个亚族。

功能型分子标记(ISAP)的开发及评价

分子标记在图谱构建,QTL分析,基因定位以及标记辅助育种中起着越来越重要的作用。研究者都期望一个分子标记位点代表一个特定的基因,甚至与某种性状联系起来,这样,通过对某个分子标记的筛选即能对性状进行筛选,此即功能型分子标记。而目前广泛使用的基于PCR基础的分子标记如RAPD、SSR、AFLP等或是扩增非编码区域,或是随机在基因组中扩增,得到的位点一般与目标性状基因距离较远,这使得分子标记在应用上与其目标有一定的偏差。研究建立了一种基于基因中内含子序列的功能型分子标记,试图使标记位点与基因序列联系起来以达到其功能型的目的。它利用内含子剪接位置的保守一致序列作为其引物的核心序列,其上下游引物均为18bp,上下游引物间通过组合配对的方式作为扩增的引物对,对真核生物的基因序列进行扩增。为了验证ISAP的功能性,研究设计了17条引物(9条上游引物,8条下游引物,共计72个引物组合)对棉花F2群体进行扩增并构建遗传连锁图谱,其中67个显示了多态性,共得到212个位点。我们用此212个位点连同164个SRAP位点构建了一张包含276个位点的遗传连锁图谱,ISAP标记在整个连锁群中分布比较均匀,部分区域呈现标记高饱和现象,可能为编码序列富集区。另外对20个片段进行测序的结果表明,85%的序列显示了与已公布EST序列的同源性,说明扩增是跨越了外显子进行的,得到的序列与表达序列紧密连锁。结果显示,ISAP标记是简单,可靠,具有较高多态性,并且扩增基因区域的一种功能型分子标记。同时,还使用ISAP标记对其他植物进行了扩增,取得了良好的效果。

利用基因芯片技术筛选棉纤维伸长相关基因

从回交近交系(backcross inbred lines,BIL)群体中选取纤维长度差异较大的两个系NMGA-062(33.03 mm)和NMGA-140(25.87 mm),利用Affymetrix棉花基因芯片,分析其开花后10 d(DPA,days post anthesis)棉纤维伸长相关基因表达谱。在24 029条转录本中,两材料间差异表达的转录本有7 282条,占总数的30.31%;其中差异表达倍数在2倍或2倍以上的转录本有3 993条,占筛选转录本总数的16.62%,功能分类表明这些转录本主要包括功能预测基因(15.57%),翻译、核糖体结构相关基因(13.54%)和翻译后修饰、蛋白质转换相关基因(9.29%)3大类。为了验证芯片数据的可信性,8个差异表达显著的基因(Ghi.10655.1.S1_s_at,ACO1,ARF1,SAHH,TUA6,TUA7,β-tub1,β-tub10)被用于实时荧光定量PCR。两种检测手段表现出一致性。随后,利用实时荧光定量PCR对3个与棉纤维相关基因(ARF1,β-tub1,β-tub10)在纤维发育不同时期(5、10、15、20和25 DPA)的表达模式进行了研究,结果表明,3个基因在纤维伸长发育时期(10和15 DPA)大量表达,推测这3个基因可能与棉纤维伸长有重要关系。

棉花叶片早衰的诊断及遗传效应分析

比较了利用活体叶片快速、无损害诊断棉花叶片早衰的SPAD差值法和绿色叶面积分级诊断方法,并分析了棉花叶片早衰的数量遗传行为。选用不同叶形和早衰类型的9个棉花品种(系),比较开花当天倒4叶及以后每5d一次的SPAD值表明,早衰棉花品种在开花35d后SPAD值明显降低,因此,将开花后35d和开花当天倒4叶的SPAD的差值作为诊断棉花叶片早衰的指标。构建持绿亲本33B和早衰亲本CJ463的6个世代(P1、F1、P2、F2、BC1和BC2),用联合尺度检验法对其叶片早衰的数据进行世代均值分析,结果表明棉花叶片早衰主要受加性遗传效应控制,至少是一对加性效应的主基因控制陆地棉叶片早衰遗传,且遗传力较高,说明对持绿材料的早代选择是有效的。总之,用SPAD差值和绿色叶面积分级两种诊断叶片早衰的方法来分析叶片早衰遗传及其与叶面积关系的结果基本一致。

棉花GhMYB0基因的克隆、表达分析及功能鉴定

MYB类转录因子是植物转录因子最大的家族之一,参与控制植物腺毛细胞的模式和形态建成。本研究利用雷蒙德氏棉(Gossypium raimondii)D5基因组数据库以AtMYB0(GL1,NM_113708)蛋白为参比序列获得同源基因GrMYB0,从徐州142中克隆了陆地棉的GhMYB0,其开放阅读框长度为843 bp,编码280个氨基酸。经过保守结构域分析和亚细胞定位确定GhMYB0为R2R3-MYB转录因子。qRT-PCR的结果表明,GhMYB0在徐州142开花当天开始高调表达,开花后20 d表达量达高峰;在所有的组织器官中,花中表达量最高,其次为胚珠。转基因功能分析结果表明,在野生型拟南芥(Columbia)中过表达GhMYB0,使其叶片表皮毛与野生型相比明显减少;该基因在拟南芥突变体gl-1中过表达,能恢复表皮毛缺失型突变体的表型,说明该基因可能对拟南芥表皮毛的形态建成发挥一定作用,本试验为研究R2R3-MYB转录因子在棉纤维起始和伸长过程中的调控作用提供有力证据。

棉花航天诱变敏感材料的筛选及多态性分析

利用"实践八号"育种卫星搭载棉花10个品种(系),对SP1代、SP2代进行了突变体的筛选、DNA分子标记检测和田间农艺性状调查,研究棉花不同材料对航天诱变的敏感性。其中7个材料对航天有一定的敏感性,其分子标记多态性高,田间农艺性状变化明显。结果表明,太空能够诱导棉花种子发生基因变异,航天诱变可作为棉花种质资源创新和品种选育的方法之一。

棉花优异品质及抗性基因挖掘与分子育种

棉花品质、产量、抗性等均是多基因控制的数量性状,其表现型受基因型和环境的共同影响,且纤维品质和产量性状之间存在较大的负相关,采用常规育种手段实现棉花纤维品质与产量的同步改良具难度很大,针对棉花品质、产量、抗性等性状形成的遗传基础这一关键科学问题,棉花品种分子设计研究团队以陆陆种内分离群体、陆海种间分离群体等材料,交叉利用分子数量遗传学、功能基因组学和分子育种学等研究手段,在陆地棉优质品质及抗性基因挖掘、海岛棉优质品质及抗性基因挖掘以及分子标记辅助方法开发及棉花新品种培育等方面取得了一系列研究成果。为棉花品质、产量、抗性性状形成的同步改良奠定了重要基础。

棉花纤维发育相关基因表达谱的比较分析

本研究通过3年4环境的田间试验,在BIL(backcross inbred lines)群体中选取断裂比强度最大的材料NMGA-062(32.5cN/tex)和断裂比强度最小的材料NMGA-144(26.67cN/tex),利用Affymetrix棉花基因芯片,比较分析NMGA-062和NMGA-144纤维发育10d时的基因表达谱。在24029条转录本中,两个基因型中差异表达的转录本6504条,占筛选转录本总数的27.07%;其中差异表达倍数在2倍或2倍以上的转录本有3461条,占筛选转录本总数的14.41%,对其进行功能分类。对8个差异表达明显的基因(Ghi.10655.1.S1_s_at,ACO1,ARF1,SAHH,TUA6,TUA7,β-tub1,β-tub10)进行实时荧光定量PCR的检测,发现表达模式均与芯片结果一致,说明芯片数据具有生物学意义上的可重复性,结果是可信的。本研究为以后克隆及功能验证纤维发育相关基因提供了重要参考。

油脂形成期棉花种子全长cDNA文库的构建

提取海岛棉7124开花后25~35 d胚的总RNA,利用SMART技术,经21轮LD-PCR扩增获得全长双链cDNA,经SfiⅠ酶切、层析柱分离后,收集500 bp以上的片段与pDNR-Lib载体连接并转化到感受态DH10B细胞,构建了棉花种子全长cDNA文库。所构建的原始文库库容为5×106,文库滴度为1.5×108cfu.mL-1。在文库中随机挑取180个克隆进行PCR检测,结果显示,文库中插入片段长度为0.5~2.5 kb,将挑取的180个单克隆进行EST测序,无空载序列,说明文库重组率为100%;序列分析结果表明,其中与油脂形成相关的EST有13条。以上数据说明构建的文库质量较高,为进一步从文库中分离棉花脂肪酸代谢关键基因,提高棉花含油量奠定了基础。

利用基因芯片技术筛选棉花产量性状相关的基因

根据皮棉产量数据的重复性测验及显著性分析,从SG747(Gossypium hirsutum L.)和Giza75(Gossypium Barbadense L.)的回交自交系群体中选取高产组和低产组品系各3个材料,取这2组材料和其父母本开花后10 d的纤维进行芯片分析。比较芯片数据,获得了1508个差异表达基因。对这些差异表达基因进行聚类分析,结果显示高产组品系和低产组品系分别聚类在一起,符合基于田间数据分组的预期结果。利用Blast2GO软件对1508个差异表达基因进行Blast-Mapping-Annotation-KEGG分析,结果表明参与细胞质膜发育、过氧化物酶活性、抗逆和营养物质运输等生物学过程的基因最多。进一步利用RT-PCR分析,得到一系列与纤维品质和产量等性状密切相关的基因。研究结果为棉花高产基因工程和分子育种提供了丰富的基因资源。

利用马克隆值差异显著的BILs鉴定棉纤维品质相关基因

【目的】马克隆值是衡量棉纤维品质的重要指标之一。利用马克隆值存在显著差异的2个陆海回交近交系材料进行高通量基因芯片分析,旨在筛选和鉴定棉纤维发育相关的关键基因。【方法】从SG747(Gossypium hirsutum L.)和Giza75(Gossypium Barbadense L.)高世代回交近交系(Backcross Inbred Lines,BILs)群体中选取NMGA-140(马克隆值6.2)和NMGA-051(马克隆值4.0)为材料,利用Affymetrix公司的棉花寡聚核苷酸基因芯片对其开花后10 DPA(Days after anthesis)的棉纤维进行了表达谱分析。【结果】获得了2655个差异表达基因,包括功能预测基因(15.57%),翻译、核糖体结构与生物合成相关基因(13.54%)和翻译后修饰、蛋白质转换、分子伴侣相关基因(9.31%)等。推测β-tub10正向调控棉纤维发育过程,β-tub1负向调控棉纤维发育过程,Ghi.3578.1.S1_s_at在棉纤维发育早期起到了作用。【结论】为棉花纤维品质的遗传改良提供了丰富的基因资源,为分子标记辅助育种开发更多新的分子标记。

棉花种子发育过程中脂肪及脂肪酸积累模式研究

通过对徐州142及其无绒无絮突变体不同发育时期棉子脂肪和脂肪酸组成含量的测定,分析棉子发育过程中脂肪及脂肪酸组成的积累模式。发现2个材料的棉子从开花后20 d到成熟这一阶段脂肪积累呈上升趋势,其中成熟种子含油量达到最高,且无绒无絮突变体材料各时期棉子脂肪含量都高于野生型。2个材料棉子发育过程中先后有8种脂肪酸成分出现,其中成熟棉子中油酸(C18:1)与亚油酸(C18:2)含量占脂肪酸总含量的72%左右,是棉子脂肪酸的重要组分。对棉子发育过程中各脂肪酸组成含量做相关分析发现徐州142中C18:1与C18:2呈一定正相关但不显著,而突变体材料中则呈极显著正相关。棉花的溶血磷脂酸酰基转移酶基因(Gh LPAAT1和Gh LPAAT2)在不同发育时期棉子中的表达水平与棉子脂肪积累趋势基本一致,推测其参与了棉子脂肪的积累。

海岛棉pepc基因的克隆及序列和表达分析(英文)

磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(Phosphoenolpyruvate carboxylase)对植物生理功能行使重要的调节作用。本研究根据NCBI已公布的EST序列利用RACE和genome walking技术从海岛棉品种7124中克隆了一个新的pepc基因,命名为Gb.pepc3。该序列全长3259 bp,含有一个2910 bp的开放阅读框,编码969个氨基酸,推测分子量为110.7 kd,等电点为6.08 I。对Gb.pepc3蛋白的同源性比对和系统进化树分析显示,Gb.pepc3与已报道的其他植物的pepc相似性很高,属于C3型pepc。荧光定量PCR结果显示Gb.pepc3在棉花各组织中广泛存在,其中在胚中表达量最高,在纤维中表达量较低。在棉花发育各个阶段Gb.pepc3表达量不同,海岛棉在开花后15天Gb.pepc3表达量达到高峰期,而陆地棉开花后20天Gb.pepc3表达量达到高峰期。海岛棉和陆地棉间表达量差异明显。

雷蒙德氏棉和亚洲棉基因组数据中LPAAT基因家族的发掘及其同源基因在陆地棉材料中的表达分析

溶血磷脂酸酰基转移酶(Lysophosphatidic acid acyltransferase,LPAAT)是油脂合成途径中的一个关键酶,能催化溶血磷脂酸转变为磷脂酸。本研究从雷蒙德氏棉(G.raimondii,D5)和亚洲棉(G.arboreum,A2)的基因组数据中得到17个LPAAT基因家族成员。利用生物信息学方法对二倍体棉花LPAAT基因进行基因结构、染色体分布以及系统进化分析。结果表明,LPAAT基因家族根据亲缘关系的远近可以分为不同的亚家族,各亚家族中LPAAT基因具有相似的基因结构;LPAAT家族基因编码的氨基酸序列具有3个保守基序,其中包括ΦFPEGTR-G结合位点和Φ-NHQS-ΦDΦΦ催化位点;通过对不同物种的LPAAT基因家族进行系统进化分析可知,不同物种中的LPAAT在进化中存在较大差异。基于陆地棉(G.hirsutum)不同发育时期的胚珠RNA-seq数据库和q RT-PCR表达分析,发现LPAAT基因可能对脂肪积累起到积极作用。本研究结果有助于了解棉属植物LPAAT基因家族的功能,以期从中选取较好的LPAAT基因进行进一步功能验证。

棉花PEPC基因种子特异性ihpRNA表达载体的构建及鉴定

磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(phosphoenolpyruvate carboxylase,PEPC)是控制植物体中蛋白质和脂肪酸含量比例的关键酶。本研究从棉花中克隆得到PEPC基因,长度为433bp,并将该基因的正反义片段分别和种子特异性启动子napin启动子(1123bp)、α球蛋白B基因启动子(1149bp)连接,插入到植物表达载体pCADS1341中。经酶切和PCR鉴定,成功的构建了PEPC基因的种子特异性ihpRNA表达载体pCADSNPSPA和pCADSBPSPA,为后期高含油量棉花材料的选育打下了基础。

优质高产棉花杂交种中棉所101

简要介绍了中棉所101的选育过程、特征特性以及高效栽培技术要点。

抗虫棉花杂交种中棉所86的选育

1选育过程 中棉所86（原系名中杂5号）于2003年以中抗58A为母本，中棉所45为父本进行杂交。2004—2006年该杂交组合F1在本课题试验地进行比较试验。

低酚转基因抗虫棉品种GB821

GB821是低酚、转基因抗虫常规棉品种,生育期118 d左右,植株塔形,结铃性较强,单株结铃数17.2,铃重5.2 g,籽指10.3 g,衣分40.0%,抗枯萎病、耐黄萎病。2018―2019年冀中南春播常规低酚棉组区域试验中,籽棉、皮棉、霜前皮棉产量较对照邯无198分别增加2.4%、7.4%、6.0%。主要介绍了GB821的选育过程、特征特性、适宜种植区域及栽培技术要点。

棉花嫁接技术及栽培管理要点

植物嫁接技术起源于我国周秦时期,距今已有2300多年。随着嫁接技术的不断发展壮大,突破其传统上的繁殖意义,而其被广泛应用于植物栽培、育种实践和基础理论研究等方面。近年来,粮棉争地矛盾突出;棉花作为抗干旱、耐盐碱经济作物,逐步转向恶劣的生长环境,同时棉花的枯黄萎病发生区域不断扩大蔓延,棉花生产损失严重。由于棉花遗传基础比较狭窄,棉花育种工作突破性进展受到抑制,采用陆、海棉花嫁接技术可克服远缘杂交的困难，同时，缩短有性杂交育种的周期，提高产量和品质；集高产、优质、多抗于一体，实现棉花超高产、稳产、抗病、优质的目标。