Rab7基因沉默对巨噬细胞中R848激活的细胞因子及MAPK信号通路影响

目的:本实验阐述了Rab7对Raw264.7巨噬细胞中R848激活TLR7(Toll like receptor-7)所产生的细胞因子的影响,并探讨Rab7对MAPK信号转导的影响。方法:使用Rab7刺激silence-Rab7-Raw264.7细胞,检测R848激活TLR7后产生的TNF-α、IL-6、IFN-α、IFN-β与IP-10,通过Western blot检测MAPK的磷酸化水平,分析Rab7对MAPK的信号转导的作用。结果:Rab7对TLR7激活后细胞因子的产生具有抑制作用,Rab7对MAPK信号通路具有抑制作用。结论:本实验结果进一步说明Rab7是TLR7信号转导通路的负向调控因子,并且参与到MAPK信号通路中。

Rab5a促进LPS活化的巨噬细胞中细胞因子的表达

目的:建立稳定表达Rab5a及其失活突变体Rab5a N133I巨噬细胞系,并分析Rab5a对LPS刺激的RAW264.7巨噬细胞中i NOS、TNF-α和IL-6表达的影响。方法:将Rab5a及其失活突变载体Rab5a N133I转染RAW264.7细胞,通过G418筛选稳定表达细胞系。通过Real-time PCR鉴定稳定表达细胞系。MTT法分析其生长特性,LPS刺激稳定表达细胞系不同时间,检测i NOS、TNF-α和IL-6的表达水平。结果:转染Rab5a/Rab5a N133I细胞Rab5a mRNA水平显著高于对照(P<0.05)。Rab5a过表达促进RAW264.7细胞增殖,而过表达Rab5a N133I细胞增殖显著慢于对照(P<0.05)。Rab5a过表达后,LPS诱导的RAW264.7细胞中i NOS、TNF-α和IL-6的表达显著增高(P<0.01)。然而,过表达Rab5a N133I对LPS诱导的i NOS、TNF-α和IL-6的表达没有显著影响。结论:Rab5a过表达显著促进了LPS活化的RAW264.7细胞中i NOS、TNF-α和IL-6的表达,这种促进作用依赖于其结合GTP的能力。

益生菌L.Casei hang对大鼠急性肝损伤的保护作用及其对TLR4-ERK-PPAR-γ通路的影响

目的:研究益生菌L.Casei Zhang(LCZ)对大鼠急性肝损伤的保护作用并探讨相关机制。方法:48只Wistar大鼠随机分为4组:对照组、模型组、益生菌组和地塞米松组。采用腹腔注射脂多糖(LPS)和D-氨基半乳糖(D-GalN)建立大鼠急性肝损伤模型。益生菌组在造模前连续30天灌服LCZ(1×109CFU)。地塞米松组在造模前腹腔注射地塞米松(10 mg/kg)。造模后16小时处死大鼠,检测血清中ALT和AST的变化、检测肝脏匀浆中TNF-α和NO的表达。采用免疫组化方法检测肝脏组织中TLR4和p-ERK的表达水平;采用RT-PCR和Western blot方法检测肝脏中PPAR-γ表达的变化。结果:益生菌组和地塞米松组血清ALT、AST以及肝脏中TNF-α和NO表达显著低于模型组。同时,组织切片显示,肝细胞坏死程度也显著减轻。免疫组化结果显示,与模型组相比,益生菌组和地塞米松组肝脏中TLR4和p-ERK水平也显著降低。PPAR-γ表达在模型组中显著降低,在益生菌组和地塞米松组表达又有所恢复。结论:益生菌L.Casei Zhang对LPS/D-GalN诱导的大鼠急性肝损伤有保护作用,该作用与抑制TLR4-ERK通路以及上调PPAR-γ的表达有关。

乳腺癌细胞中Rab7基因的克隆及序列分析

本实验主要是从人乳腺癌细胞中克隆Rab7基因并进行基因序列比对和分析。通过培养乳腺癌细胞MCF-7和MDA-MB231,提取细胞总RNA,逆转录为cDNA,以此cDNA为模板,根据GenBank公布的人Rab7全长序列设计引物,扩增Rab7基因的开放阅读框。将其与真核表达载体pc-DNA3.1连接,构建pcDNARab7重组质粒。测序后发现MCF-7细胞中克隆的Rab7序列与GenBank序列的同源性为91%,发生了多处突变,其中94.4%为同义突变,5.5%为错义突变。但是MDA-MB231细胞中克隆的Rab7基因序列与GenBank中的Rab7序列的同源性为100%。由于发现Rab7在MCF-7乳腺癌细胞中发生突变,而在MDA-MB-231乳腺癌细胞中基因未发生突变,我们推测Rab7基因的突变是否与乳腺癌的产生有关系,这个发现为以后研究Rab7与乳腺癌的关系奠定了基础。

益生菌Lactobacillus Casei Zhang对巨噬细胞中NO/iNOS表达的影响及其机制

目的：研究益生菌L.Casei Zhang对巨噬细胞RAW264.7中NO/iNOS表达的影响及探讨相关机制。方法：1×10-6CFU益生菌L.Casei Zhang与巨噬细胞RAW264.7细胞共培养2h,6h,12h,24h。收集细胞培养上清,检测NO的表达变化。通过Real-rime PCR检测iNOS、TLR2和TLR4表达的变化。L.Casei Zhang与RAW264.7共培养3h后,以LPS、CpG和PolyI：C刺激细胞,检测NO和iNOS表达的变化。结果：益生菌L.Casei Zhang促进了巨噬细胞中NO分泌和iNOS的表达。与TLR2的本底表达相比,L.Casei Zhang上调了RAW264.7细胞中TLR2的表达。TLR4 mRNA的表达在L.Casei Zhang与RAW264.7细胞共培养后2h显著增高。LPS和PolyI：C活化的巨噬细胞在L.Casei Zhang预处理后,NO/iNOS的表达水平显著降低。结论：益生菌L.Casei Zhang促进巨噬细胞中NO/iNOS的表达与促进TLR2和TLR4的表达有关。L.Casei Zhang抑制了LPS和PolyI：C诱导的巨噬细胞中NO/iNOS的表达。该研究为进一步阐明益生菌的免疫调节作用奠定了基础。