重叠PCR法构建人心房肌SK2(KCNN2)基因表达质粒及鉴定和序列分析

目的:小电导钙激活钾通道亚型2(SK2)在心房肌功能活动中起重要作用,但是由于其表达密度低,直接进行RT-PCR一步法无法得到该基因(KCNN2)的编码区全长序列,本研究旨在采用Overlapping PCR(重叠PCR)法进行基因全长序列的扩增和表达质粒的构建,探讨其在长片段基因扩增的应用。方法:收集人心房肌标本,采用提取总RNA之后逆转录为cDNA,分三段设计KCNN2基因(AY258141)引物进行分段扩增,同时进行分段测序,然后采用Overlapping PCR得到KCNN2基因编码区全长序列,通过限制性酶切位点定向克隆到表达载体pIRES-hrGFP上。采用酶切法和测序法进行鉴定。结果:三段KCNN2基因扩增产物大小与预测值一致,最后得到的表达质粒测序结果与基因库数据基本一致。结论:成功构建人心房肌SK通道基因表达质粒pIRES-hrGFP-SK2,Overlapping PCR能够很好的用于长片段基因扩增。

骨骼肌兴奋——收缩耦联的进化

近年的研究表明,骨骼肌兴奋——收缩耦联（ECC）发生机理依动物不同而异,以下介绍在对低级和高级动物对比研究中,所发现的ECC的进化、改变,这些变化不仅具有生物学意义,对基础医学特别是生理学研究也有重要意义。高等脊椎动物骨骼肌ECC发生中有一独特表现:并不伴有自细胞外向细胞内的Ca2+

人心房肌小电导钙激活钾通道在HEK293细胞上的表达与电生理学特性

目的:克隆人心房肌小电导钙激活钾通道亚型2(SK2),构建稳定表达SK通道的HEK293细胞系并研究其基本电生理学特性。方法:以人心房肌为标本,通过逆转录,重叠PCR法和定向克隆构建真核表达载体pIRES-hrGFP-SK2,采用脂质体法转染至HEK293细胞并筛选稳定表达的细胞系;使用全细胞和单通道膜片钳技术进行电流记录,研究其基本电生理学特性。结果:全细胞和单通道膜片钳均能在表达的HEK293细胞上记录到SK2通道电流,其电流具有明显的胞内钙离子依赖性。结论:成功构建稳定表达人心房肌SK2通道的HEK293细胞系,为以后研究通道功能活动奠定了基础。

粉防己碱对猪冠状动脉平滑肌细胞钙激活钾通道的作用

目的:研究粉防己碱(Tet)对猪冠状动脉平滑肌细胞(SMC)钙激活钾通道(K_(Ca))的作用。方法:用膜片钳单通道技术确定通道的变化。结果:Tet 浓度依赖性地可逆性阻断 SMC 上的 K_(Ca)。细胞膜内侧面加入 Tet 20、30×10^(-6)mol·L^(-1)可分别使通道开放概率降低(58.2±20.3)%、(64.6±16.6)%,平均开放时间从(2.3±0.7)ms 减少到(2.0±0.8)ms 和(1.6±0.6)ms,平均关闭时间从(68.1±39.3)ms 减少到(64.0±62.4)ms 和(37.0±16.6)ms。随 Tet 浓度的增加,通道活动逐步完全抑制。结论:Tet 是一种天然有效的SMC 上 K_(Ca)抑制剂。

原代培养猪冠脉平滑肌细胞的电压依赖和钙激活的钾通道

作者应用改良的细胞膜片钳制技术对原代培养的猪冠状动脉平滑肌细胞的电压依赖性和钙激活的钾通道的特性进行了研究。整个实验均在计算机的控制下进行,各种膜片中引导出的电流,通过膜片钳制放大器后,均输入至计算机进行采样、存贮和分析。结果显示:①这种通道活动呈明显的电压依赖性,随膜的去极化而激活。