水痘-带状疱疹病毒疫苗株ORF62碱基突变及ORF62编码IE62反式激活力的分析

目的分析水痘-带状疱疹病毒（VZV）疫苗株（vOka）ORF62碱基突变及ORF62编码即刻早期蛋白（IE62）对VZV基因启动子的反式激活力。方法分别以vOka及其亲本株（pOka）基因组DNA为模板，PCR扩增获得ORF62全序列，克隆到高效表达质粒pCAGGS中构建vOka和pOkaORF62表达质粒；采用双脱氧核苷酸链末端终止法对表达质粒中ORF62测序；应用基因转染瞬时表达技术比较vOka和pOkaIE62在MeWo和CV1细胞中对VzV基因启动子的反式激活力差别。结果成功构建vOka和pOkaORF62表达质粒pCAG-vOka62和pCAG-pOka62；测序结果发现，与pOka比较，vOkaORF62至少有9个碱基突变，其中106262、107136和107262位点碱基突变后分别产生SmaⅠ、BssHⅡ和NaeⅠ酶切位点。vOka IE62在MeWo细胞中对ORF4、ORF10和ORF61启动子的反式激活力低于pOka IE62，但在CV1细胞中对ORF9启动子的反式激活力高于pOka IE62。结论利用vOkaORF62碱基突变产生的酶切位点可鉴别vOka和pOka，vOka和pOkaIE62对VZV基因启动子的反式激活力差别可能与转染细胞类型有关。

应用水痘-带状疱疹病毒报告细胞系筛选抗病毒药物的研究

目的应用构建的水痘．带状疱疹病毒（VZV）报告细胞系MVgG建立一种筛选抗VZV药物的新方法。方法将VZV疫苗株（vOka）的无细胞病毒液（CFV）直接感染MV9G细胞2h后移除（CFV直接感染法），或将感染vOka株的Mewo细胞（含带细胞病毒，CAV）与MV9G细胞共培养48h（CAV共培养法），以激发MV9G细胞表达报告基因萤火虫荧光素酶。在培养基中加入肝素、磷酸甘露糖（M-6-P）、阿昔洛韦（ACV）、白藜芦醇、roscovitine等抗病毒药物，通过比较加药前后MV9G细胞荧光素酶活性变化来分析药物对VzV的作用。结果抗病毒药物各浓度组不同程度地抑制CFV直接感染和／或CAV共培养激发的MV9G细胞荧光素酶活性，荧光素酶活性的降低与平行对照组中病毒蚀斑数的降低一致。抗病毒药物中肝素、M-6-P和roscovitine2．5μmol／L组抑制CFV激发荧光素酶的作用强于抑制CAV激发荧光素酶的作用，而ACV和白藜芦醇抑制CAV激发荧光素酶的作用强于抑制CFV激发荧光素酶的作用。ACV抗药株Kanno和rOkaYSR的CAV与MVgG细胞共培养均激发其强表达荧光素酶，但ACV抑制抗药株激发荧光素酶50％时浓度（IC50）显著高于抑制敏感株pOka和CaGu的IC50。结论CFV直接感染法和CAV共培养法分别有助于筛选针对VZV感染早期和后期的药物，利用MV9G细胞建立的报告细胞法可为抗VzV药物筛选和作用机制研究提供一种简便、快速、敏感和高通量的新方法。

白黎芦醇体外抑制水痘-带状疱疹病毒作用机制的研究

目的应用构建的水痘-带状疱疹病毒（VZV）报告细胞系MV9G进一步研究白黎芦醇体外抑制VZV的作用机制。方法将无细胞VZV直接感染MV9G细胞（CFVs直接感染）或将带细胞VZV与MV9G细胞共培养（CAVs共培养）以激发MV9G细胞表达报告基因萤火虫荧光素酶。在CFVs直接感染前或CAVs共培养不同时间点加入白黎芦醇，通过比较药物对CFVs或CAVs激发荧光素酶的抑制强度分析白黎芦醇直接灭活病毒、抑制病毒黏附和穿透、抑制病毒在细胞内复制及其时间点和可逆性；通过比较药物作用前后VZV即刻早期蛋白62（IE62）mRNA拷贝数和IE62表达强度变化分析白黎芦醇对IE62转录和表达的抑制作用。结果白黎芦醇〉30．0μg／ml时MV9G细胞三磷酸腺苷（ATPs）含量随药物浓度升高而逐渐降低，ATPs降低50％时白黎芦醇浓度（CD50）约60．3μg/ml。CFVs与白黎芦醇（25．0μg/ml）预混37℃水浴孵育2h后直接感染MV9G细胞，CFVs激发荧光素酶下降50％。MV9G细胞在含白黎芦醇培养基中37％孵育2h后直接感染CFVs，CFVs激发荧光素酶随药物浓度升高而逐渐降低，但4℃孵育时无显著变化。在CAVs共培养中加入白黎芦醇后CAVs激发荧光素酶显著降低，药物抑制荧光素酶50％时浓度（IC50）约8．7μg/ml。分别在CAVs共培养3、6、9、12、24、30和36h时加入白黎芦醇，3～24h加药各组CAVs激发荧光素酶均显著高于对照组，但1h、30h和36h加药组与对照组问差异无统计学意义。CAVs共培养时撤除白黎芦醇后CAVs激发荧光素酶显著高于撤药前，尤以24h和72h撤药组明显。VZVIE62mRNA拷贝数和IE62抗体阳性细胞数随药物作用时间延长而逐渐降低。结论白黎芦醇细胞毒性较强，MV9G细胞可耐受最高浓度为30．0μg／ml。白黎芦醇部分灭活CFVs、抑制CFVs穿透MV9G细胞但对CFVs黏附MV9G细胞无影响，以浓度依赖方式可逆性抑制CAVs细胞内复制。白黎芦醇可能通过抑制IE62基因的转录和表达而抑制VZV感染的早期阶段。

国产水痘减毒活疫苗株即刻早期基因ORF62的特征

目的：通过比较国产水痘减毒活疫苗株（ vOka ）与其父系株（ pOka ）即刻早期基因（ IE） ORF62启动子区序列及其启动活力、编码区序列及其反式激活力差别，探讨vOka株ORF62突变在其减毒机制中的可能作用。方法分别构建pOka株、长春百克生物科技股份公司vOka-BK株、上海生物制品研究所vOka-SH株和葛兰素史克公司vOka-GSK株（对照） ORF62启动子-报告子质粒和ORF62编码区表达质粒，通过测序分析ORF62启动子区和编码区序列差异，再应用基因转染瞬时表达技术分析3株vOka与pOka株ORF62启动子活力及ORF62编码IE62对即刻早期基因ORF4、早期基因ORF28和晚期基因ORF67启动子的反式激活力差异。结果与pOka株比较，3株vOka 一致存在ORF62启动子区110050位点T缺失突变，该突变未导致启动子区的转录因子结合基序改变，但3株vOka ORF62启动子的启动活力显著低于pOka株；3株vOka ORF62编码区存在一致的碱基置换突变并分别产生SmaⅠ、NaeⅠ和BssHⅡ新酶切位点；除vOka-SH株IE62在CV-1细胞中对ORF4启动子的反式激活力显著低于pOka株外，3株vOka IE62在CV-1和MeWo细胞中对ORF4、ORF28、ORF67启动子的反式激活力均显著高于pOka株。结论3株vOka ORF62启动子区110050位点T缺失突变可能是启动子活力降低和IE62反式激活力改变的原因之一，vOka与pOka株ORF62启动子活力和IE62反式激活力差异与转染细胞类型关系不大。

宇香色酮和槲皮素体外抑制水痘-带状疱疹病毒作用机制比较

目的：应用基于水痘-带状疱疹病毒（VZV）报告细胞系MV9G建立的报告细胞法比较宇香色酮和槲皮素体外抑制VZV的作用机制。方法测定宇香色酮、丁子香酚、桑色素、姜黄素、杨梅黄酮、槲皮素等中药或植物成分体外抑制 VZV 的选择指数（SIs），进一步应用无细胞病毒（CFVs）直接感染法和带细胞病毒（CAVs）共培养法分析SIs较高的化合物在直接灭活CFVs、抑制CFVs黏附和穿透、抑制CAVs细胞内复制、抑制病毒即刻早期基因62（IE62）转录和表达等方面的作用。结果宇香色酮和槲皮素SIs相对较高，分别为5.82和8.97。宇香色酮部分灭活CFVs并抑制CFVs黏附和穿透MV9G细胞，槲皮素无此作用。宇香色酮和槲皮素可逆性抑制CAVs细胞内复制以及病毒IE62基因转录及IE62抗原表达，但宇香色酮需在感染12 h内加入。结论宇香色酮和槲皮素体外抑制VZV作用机制有差异，抑制病毒IE62基因转录和表达是其共同机制之一。

水痘-带状疱疹病毒基因启动子分析

目的 从水痘-带状疱疹病毒（VZV）主要基因的启动子中找到最容易被VZV感染激活的启动子及其最短有效序列以构建VZV报告细胞系。方法 构建18个VZV开放读码框架（0RF）启动子的重组报告质粒，用基因转染瞬时表达分析法比较各启动子在VZV感染早期启动报告基因产物表达的活性；将最容易被激活的启动子从5′和3′端截短后构建截短启动子的重组报告质粒，比较各截短启动子的活性以找到启动子的最短有效序列；应用点定向突变技术将最短有效序列中细胞转录因子的结合序列进行碱基置换突变后比较突变启动子的启动活性。结果ⅥⅣ感染早期ORF9、ORF61和ORF66的启动子最容易被激活；ORF9启动子的最短有效序列位于-127～-34（93bp），其上游刺激因子（USF）结合序列的碱基置换突变后启动子活性降低50％；ORF61启动子的最短有效序列位于-227～-52（165bp），其Pbx-1结合序列的碱基置换突变后启动子活性增强一倍，但NF-κB结合序列的突变对启动子活性无影响。结论 ORF9启动子的最短有效序列最适合用来构建VZV报告细胞系。

水痘-带状疱疹病毒报告细胞系的构建及特性分析

目的利用水痘-带状疱疹病毒（VZV）ORF9启动子的最短有效序列ORF9G和ORF61启动子的最短有效序列ORF61F构建VZV报告细胞系并分析其特性。方法分别将ORF9G和ORF61F自身首尾连接得到串联启动子TgG和T61F，再分别将TgG和T61F克隆到报告子质粒pGL3-basic中构建串联启动子-报告子重组质粒pGL-TgG和pGL-T61F，质粒中报告基因萤火虫荧光素酶的表达由上游串联启动子控制；将pGL-TgG、pGL-T61F分别同G418抗性质粒pCMV-script恒定转染到人黑色素瘤细胞系MeWo后培养至G418抗性细胞克隆生长；收集G418抗性细胞克隆，测定其感染VZV后萤火虫荧光素酶的表达强度，筛选信噪比高的细胞克隆作为VZV报告细胞系，并分析其灵敏度、特异性等主要特性。结果串联启动子TgG和T61F分别较其单拷贝启动子9G和61F活性增加1倍；分别利用pGL-TgG和pGL—T61F成功构建了VZV报告细胞MV9G和MV61F；两个报告细胞在感染最低50PFU VZV 24h时即能检测到萤火虫荧光素酶的强表达，表达强度与感染病毒量呈线性正相关，但感染人巨细胞病毒（HCMV）、人类疱疹病毒6（HHV-6）和HHV-7时无表达；MV9G的灵敏度较MV61F略高。结论MV9G和MV61F均可作为敏感、特异的VZV报告细胞系供进一步研究用。