伪狂犬病病毒在小鼠原代神经细胞中潜伏感染模型的建立

缺少PRV良好的潜伏感染模型已成为研究其潜伏感染机制的障碍。为建立PRV潜伏感染的体外细胞模型,本研究通过分离新生鼠背根神经节(DRG)获取神经细胞,并利用间接免疫荧光试验(IFA)对其进行鉴定,获得了DRG中的神经细胞。采用重组报告病毒r PRV-EGFP感染神经细胞,同时添加阿昔洛韦(ACV)抑制病毒复制以建立潜伏感染,并采用棋盘法对病毒感染剂量和ACV浓度进行优化,结果显示,感染复数(MOI)为0.001,ACV浓度为0.5 mmol/L,病毒能够在神经细胞中稳定建立潜伏感染。采用荧光定量RT-PCR、病毒滴度测定、药物刺激再激活的方法对潜伏感染模型鉴定,结果显示,潜伏感染时病毒不能复制,且不产生感染性病毒粒子;而经LY294002(PI3K抑制剂)诱导病毒再激活后,病毒大量复制并产生感染性病毒粒子。本研究首次利用小鼠原代神经细胞建立了PRV的潜伏感染模型,该模型的建立为PRV潜伏感染机制的研究奠定了基础。

病毒靶向抗原递呈细胞调控细胞免疫应答的研究进展

细胞免疫是参与免疫应答的细胞之间相互作用从而发挥免疫功能。细胞免疫应答是机体抵御外来病原体侵袭的重要防线,在免疫保护中发挥着重要作用。然而,许多病毒通过靶向抗原递呈细胞抑制或逃避细胞免疫来实现其在宿主体内的复制。因此,本文主要针对细胞免疫应答的作用及其主要过程、参与调控细胞免疫应答的抗原递呈细胞及其机制的最新研究进展进行了概述,为深入研究病毒调控细胞免疫应答的机制提供思路并为设计基于细胞免疫应答的新型疫苗提供参考。

生物安全在养猪业的发展与应用

随着规模化养猪的快速发展,烈性传染病造成的经济损失越来越大,而建立科学、高效的生物安全体系是有效预防和控制动物传染病的重要措施。在养猪生产过程中采取生物安全措施可以阻止或减少外部病原的引入(外部生物安全)及病原在养殖场内的传播(内部生物安全)。同时,科学的生物安全体系还有助于提高养殖生产效率、减少药物和疫苗的使用量。文章综述了目前国内养猪业主要采取的生物安全措施,同时系统分析了美洲和欧洲国家生物安全措施在猪场应用的发展历程,以期为完善我国养猪业生物安全防控体系提供借鉴。

蛋白质棕榈酰化修饰调控蛋白质功能的研究进展

蛋白质是生命的物质基础,也是基因功能的执行者。蛋白质需要经过基因转录、转录后加工、翻译、翻译后加工及转运等多个复杂过程后才具有生理功能。蛋白质翻译后加工修饰形式包括磷酸化、糖基化、甲基化、羟基化、泛素化及脂质化等[1],其中脂质化修饰是一种重要的翻译后加工修饰形式。

非洲猪瘟疫苗的研发策略与应用前景:可行性和可能性

非洲猪瘟(African swine fever, ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus, ASFV)感染猪而引起的一种烈性传染病,强毒株急性感染死亡率可高达100%。当前,ASF全球流行与危害不断加剧。该病自2018年传入我国后,经过3年多的流行,最初暴发的基因Ⅱ型ASFV强毒株,已演化出弱毒株。2021年又出现了基因I型低毒力ASFV的流行,使我国ASF防控和根除面临的形势更加严峻和复杂。作为传染病防控的有效利器,ASF疫苗的研发受到政府、生猪养殖、疫苗制造企业和科学界的广泛关注。随着相关科研经费的不断加大,近年来基于灭活、减毒、亚单位、病毒载体和DNA等疫苗研发策略,在ASF疫苗研究中取得空前进展,加深了对ASF疫苗研发与评价的科学认知。当前,部分ASF疫苗候选株已经或即将进入临床试验阶段,应用前景较为乐观,但仍有一些问题亟待解决。本文结合国内外ASF疫苗最新研究成果与观点,系统总结了不同疫苗研发策略的优势和劣势及其面临的技术瓶颈,现有ASF疫苗候选株的科学评价,并对未来安全高效ASF疫苗的发展方向与挑战,以及ASF疫苗的应用前景进行了讨论,以期为业内人士提供参考。

消毒剂的抗病毒研究进展

猪病毒性传染病发病急、蔓延快,危害大,严重影响猪只健康以及农业经济发展。对于疾病的防控主要靠疫苗免疫以及严格的生物安全措施。自2018年非洲猪瘟在中国暴发,且无商品化疫苗,各大养猪场越来越重视生物安全,将其作为防控非洲猪瘟的重要手段,而其中的消毒环节是养殖过程中的重中之重。因此,如何选择适宜的消毒剂并进行合理使用是养殖户值得注意的。本文对猪场常用消毒剂的作用机理、使用方法、评价方法以及适用范围等进行总结归纳,以期对我国消毒剂在猪场中的规范使用提供参考。

可诱导快速免疫保护兽用疫苗的种类及其诱导机体免疫反应的机制

疫苗免疫是预防传染病的重要策略。合理使用疫苗可以诱导宿主产生特异性免疫保护^([1]),优良的疫苗应当具有快速产生免疫保护和持久保护的特点。可诱导快速免疫保护的兽用疫苗能够在免疫早期激活畜禽的免疫系统,为畜禽提供快速的免疫保护,可用于畜禽的紧急免疫。本文列举了几种可诱导动物机体快速免疫保护的兽用疫苗,并阐述它们诱导快速免疫保护的关键免疫学机制,为研发可诱导快速免疫保护的疫苗提供新的思路和理论指导。

家兔ANXA1蛋白与猪瘟病毒E2蛋白相互作用并影响其复制的研究

本研究团队前期研究发现,猪瘟病毒(CSFV) HCLV株E2蛋白结构域Ⅰ (E2^(Domain Ⅰ))是HCLV株适应家兔的关键结构域,Domain Ⅰ中108位脯氨酸(P)和109位苏氨酸(T)是HCLV株适应家兔必需氨基酸。为进一步探究HCLV适应家兔的分子机制,本研究提取家兔脾脏淋巴细胞膜蛋白分别与CSFV Shimen (SM)株E2蛋白(SM E2)、HCLV株E2蛋白突变体(HCLV E2^(P108L-T109I))及HCLV株E2蛋白(HCLV E2)共孵育,经SDS-PAGE后通过蛋白质质谱鉴定,结果却意外发现,CSFV SM E2与家兔脾脏淋巴细胞膜蛋白作用后在37 ku左右处多出一条带;质谱分析结果显示其可能为细胞膜蛋白膜联蛋白1 (ANXA1),且与CSFV SM E2蛋白之间可能存在相互作用。为了分析ANXA1在HCLV适应家兔中的作用,将CSFV SM株和HCLV株分别接种家兔,48 h和72 h后分离各组兔外周血单个核淋巴细胞(PBMC),采用RT-q PCR方法检测ANXA1基因m RNA的转录水平。结果显示,与对照组相比,家兔在接种SM株和HCLV株后,ANXA1基因m RNA转录水平均显著(P<0.05)或者极显著(P<0.01)下调,且与接种HCLV株的家兔相比,接种SM株家兔中ANXA1基因m RNA的转录水平极显著(P<0.001,72 h)或者显著(P<0.05,48 h)下调,表明接种SM株后的家兔可能通过调控ANXA1的转录水平抑制SM株的复制。将pCAGGS-Flag-ANXA1和pCAGGS-Flag分别转染HKE293T细胞,48 h后收集细胞样品,通过GST pulldown验证ANXA1与CSFV SM E2蛋白的相互作用;将pCAGGS-Strep-SME2+pCAGGS-Flag-ANXA1共转染HEK293T细胞作为强毒实验组,将pCAGGS-Myc-HCLV E2+pCAGGS-Flag-ANXA1共转染HEK293T细胞作为弱毒实验组,48 h后采用Co-IP试验验证ANXA1与不同CSFV E2的相互作用。上述结果进一步表明,ANXA1与CSFV SM E2存在相互作用,但其与HCLV E2无相互作用;将pCAGGS-Strep-SME2+pCAGGS-Flag-ANXA1共转染HEK293T细胞作为实验组,采用激光共聚焦显微镜观察发现SM E2蛋白和ANXA1蛋白共定位于细胞浆中。将表达ANXA1的重组质粒转染ST细胞,48 h后分别接种CSFV SM株和HCLV株,采用RT-q PCR检测CSFV基因的拷贝数。结果显示,与转染pCAGGS-Flag的ST细胞相比,接种CSFV SM株的细胞中病毒基因拷贝数极显著上升(P<0.01),而接种HCLV株细胞中病毒基因拷贝数无明显变化。表明过表达ANXA1后可以促进CSFV强毒株的复制,但不影响弱毒株的复制。本研究首次证实,家兔脾脏淋巴细胞ANXA1通过与CSFV SM E2蛋白的相互作用促进CSFV的复制,为进一步研究CSFV E2蛋白的功能奠定了基础。

猪瘟兔化弱毒疫苗——半个世纪的回顾

猪瘟是一种严重危害养猪业的毁灭性传染病。20世纪50年代中国首创了举世闻名的猪瘟兔化弱毒疫苗(即C株),随后创制了不同的疫苗制造工艺,如细胞培养苗、乳兔组织苗和牛体反应组织苗等。C株是一株非常安全的弱毒疫苗,对各种年龄和品种的猪都没有副作用,并且有良好的免疫效力,它能同时诱导体液免疫和细胞免疫应答,对不同基因型的猪瘟病毒株均能提供有效的免疫保护。免疫母猪通过母乳可对仔猪提供被动免疫保护,但过高水平的母源抗体会影响仔猪对C株疫苗的主动免疫应答。目前已经完成了包括C株及其亲本株在内的几十株猪瘟病毒的全基因组序列测定和注释,建立了猪瘟病毒的反向遗传操作系统,初步解析了猪瘟病毒主要基因的结构与功能,并构建了不同的反向遗传操作标记疫苗,赋予了C株疫苗新的生命和内涵。C株疫苗可以用于猪瘟的控制和根除,借助于C株疫苗密集接种和综合控制措施,有关国家有效地控制了猪瘟,甚至消灭了猪瘟。尽管如此,要在全球范围内根除猪瘟,今后依然有漫长的路要走,这可能有赖于对C株进行进一步改造和利用。

猪繁殖 - 呼吸道综合征病毒(PRRSV)CH-1a株基因型鉴定

根据猪繁殖－呼吸道综合征病毒（ＰＲＲＳＶ）美洲型毒株和欧洲型毒株的基因组序列设计合成了２对引物，即１００８ＰＳ／１００９ＰＲ和１０１０ＰＬＳ／１０１１ＰＬＲ。我国分离的ＣＨ－１ａ株用这２对引物均能扩增出与预期大小相符的ＲＴ－ＰＣＲ产物，分别与美洲型代表株（ＶＲ－２３３２）的ＲＴ－ＰＣＲ产物大小相当。特异性试验表明，这２对引物均不能扩增其他常见的繁殖障碍相关病毒的ＲＮＡ或ＤＮＡ以及未感染的ＭＡＲＣ－１４５细胞ＲＮＡ。间接免疫荧光试验也证明，ＣＨ－１ａ株与ＰＲＲＳＶ核衣壳蛋白特异性单克隆抗体以及美洲型毒株抗血清均呈阳性反应。因此初步证实ＣＨ－１ａ株为美洲型ＰＲＲＳＶ。

猪生殖-呼吸道综合征病毒CH-1a株ORF2～7序列测定

新近发现的猪生殖－呼吸道综合征病毒（ＰＲＲＳＶ）是单股ＲＮＡ病毒，属于不久前成立的动脉炎病毒科。为了比较从国内分离的ＰＲＲＳＶ与欧美ＰＲＲＳＶ毒株的分子遗传学关系，本文扩增并克隆了ＰＲＲＳＶＣＨ－１ａ株ＯＲＦ２～７，测定了其核苷酸序列。用序列分析软件进行核苷酸和氨基酸序列比较分析，结果表明ＣＨ－１ａ株与欧洲型代表株ＬＶ的遗传关系较远，与北美洲型代表株ＶＲ－２３３２遗传距离最近，可能来自同一祖先。

通用伪狂犬病病毒转移载体的构建

克隆伪狂犬病病毒（ＰＲＶ） Ｂａｒｔｈａ－Ｋ６１株基因组的ＫｐｎⅠ Ｊ片段，然后亚克隆其中的ＫｐｎⅠ－ ＰｓｔⅠ片段，缺失重组质粒中的ＥｃｏＲⅠ位点和ＮｏｔⅠ－Ｈｉｎｄ Ⅲ片段；再用ＡｃｃⅠ切去３７８ｂｐ，在此缺失位置插入来源于ｐＣＲ３－Ｕｎｉ的ＣＭＶ启动子、多克隆位点和ＢＧＨ ｐｏｌｙＡ信号，构建了通用 ＰＲＶ转移载体 ｐＢｄＴＫ－Ｕｎｉ。此转移载体为改造 Ｂａｒｔｈａ－Ｋ６１株及开发二价或多价基因工程疫苗提供了有力工具。

猪生殖-呼吸道综合征病毒(PRRSV)CH-la株N基因的分子克隆、序列测定及其比较分析

根据已发表的ＰＲＲＳＶＩＡＦ－ｅｘｐ９１株的核酸序列，设计了一对特异性引物，用ＲＴ－ＰＣＲ扩增了ＰＲＲＳＶＣＨ－ｌａ株的Ｎ基因，经补平和磷酸化后，克隆到ｐＵＣ１８ＳｍａＩ位点上。经电泳分析、酶切和ＰＣＲ鉴定证实后，进行序列测定。序列分析表明ＣＨ－ｌａ株与ＩＡＦ－ｅｘｐ９１株（美洲型）Ｎ基因核苷酸同一性为９３．２％，氨基酸同一性高达９６．７％，而与ＬＶ株（欧洲株）核苷酸同一性为６３％，氨基酸同一性仅为５９％。其推导氨基酸残基分子量为１３．３ｋＤａ。根据ＣＨ－ｌａ株Ｎ基因推导的氨基酸残基缺少欧洲型毒株ＬＶ特有的两个氨基酸片段，表明ＣＨ－１ａ株与ＩＡＦ－ｅｘｐ９１株同源性高于它与ＬＶ株的同源性，而且ＣＨ－１ａ株与鼠乳糖脱氢酶增高症病毒（ＬＤＶ）在进化关系上比ＬＶ株与ＬＤＶ更密切。ＣＨ－１ａ株Ｎ基因推导的氨基酸残基Ｎ－端１／２段约２６％是由Ａｒｇ、Ｌｙｓ和Ｈｉｓ这３种氨基酸组成的，其疏水性侧像图与ＬＶ株和ＶＲ－２３３２株（美洲型）几乎相同，这表明两种基因型的核衣壳蛋白（Ｎ蛋白）具有一定的保守性。由于Ｎ蛋白是ＰＲＲＳＶ所有结构蛋白中免疫原性比较强的病毒蛋白，是现行血清学试验的抗原基础，因此Ｎ基因的分子克隆为研制ＰＲＲ?

猪生殖-呼吸道综合征病毒(PRRSV)CH-la株糖蛋白基因的遗传变异分析

新近发现的猪生殖 -呼吸道综合征病毒 (PRRSV)是单股RNA病毒 ,属于不久前成立的动脉炎病毒科。为了比较国内分离的CH la株与国外毒株的分子遗传学关系 ,扩增并克隆了PRRSVCH la株糖蛋白基因ORF2～ 5 ,测定了其核苷酸序列。用序列分析软件分析了其编码产物的分子量、等电点、疏水性、抗原性和有关位点 ,并与国外毒株进行了序列比较和系统发育进化分析。结果表明 :CH la株与VR 2 332株尽管密切相关 ,但二者之间也有较大的变异 ,且ORF3和ORF4重叠区存在一个高变区。这提示CH la株和VR 2 332株可能是北美洲型中的两个不同亚型。

高效表达重组猪IL-10的基因工程菌株的构建

白细胞介素 10(IL 10)是一种Th2细胞等产生的能抑制Th1细胞释放细胞因子的免疫调节因子。从经脂多糖(LPS)活化的猪外周血单核细胞(PBMC)中提取总RNA,用RT PCR扩增了猪IL 10(poIL 10)编码基因,克隆并测序验证后,将其亚克隆到表达载体pPROEXTMHTb中,转化DH5α后,用IPTG诱导培养,经免疫印迹和生物活性检测显示,重组菌株表达了具有活性的重组poIL 10,重组poIL 10表达水平达3mg/ml培养液,占菌体细胞总蛋白的30 2%,本研究为poIL 10的功能研究和临床应用奠定了基础。

猪生殖-呼吸道综合征病毒CH-1_株N基因的原核表达

将ＰＲＲＳＶＣＨ１ａ株Ｎ基因用ＥｃｏＲＩ和ＰｓｔＩ双酶切从重组质粒ｐＵＣ１８ＯＲＦ７切下后，插入到原核表达载体ｐＢＶ２２０的ＰＲ、ＰＬ启动子下游，得到重组表达质粒ｐＢＶ２２０ＯＲＦ７。转化了ｐＢＶ２２０ＯＲＦ７的大肠杆菌ＪＭ８３经诱导培养后，用ＳＤＳＰＡＧＥ和Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测表达产物。结果表明ＰＲＲＳＶＣＨ１ａ株的Ｎ基因在原核载体上得到高效表达，表达产物占菌体总蛋白的１５３％。表达蛋白可望成为有价值的ＰＲＲＳ诊断抗原。

一种基于塞姆利基森林病毒复制子的新型复制子载体

RNA复制子是能自主复制的病毒RNA。基于RNA复制子的表达载体和基因疫苗比常规真核表达载体和DNA疫苗具有更大的优越性。以塞姆利基森林病毒RNA复制子衍生的真核表达载体pSFV1为骨架 ,插入CMV立即早期启动子和SV40晚期Poly(A)信号 ,构建了一种完全基于DNA的复制型表达载体pSFV1CS ,将增强型绿色荧光蛋白基因EGFP插入其中 ,构建了重组质粒pSFV1CS EGFP ,通过转染 2 93T细胞 ,证实外源基因能在其中高效表达。

RNA复制子疫苗

RNA复制子是自主复制的RNA ,保留了病毒复制酶基因 ,而结构蛋白基因缺失 ,由外源抗原基因取代 ,复制酶可控制载体RNA在胞浆中高水平复制和外源基因的高水平表达。用于开发复制子的主要是单股正链RNA病毒 ,如甲病毒 (辛德比斯病毒、塞姆利基森林病毒、委内瑞拉马脑炎病毒 )、黄病毒 (登革热病毒、昆津病毒 )、小RNA病毒 (脊髓灰质炎病毒、人鼻病毒 )、副粘病毒 (犬瘟热病毒 )、杯状病毒 (猫杯状病毒 )。基于复制子的疫苗不会产生能复制的感染性病毒粒子 ,不可能与细胞基因组发生整合 ,但可诱导全身免疫和粘膜免疫以及MHC I限制性CTL反应 ,而不受体内已有载体抗体的干扰。目前已开发了大量基于复制子的疫苗和肿瘤的治疗性和预防性疫苗 ,并在很多疾病模型上取得成功 ,包括病毒 (流感病毒、人免疫缺陷病毒、拉沙病毒、马尔堡病毒、呼吸道合胞体病毒、诺沃克样病毒、马动脉炎病毒等 )肿瘤 (人乳头瘤、癌胚抗原、B1 6肿瘤、小鼠黑素瘤等 )、以及细菌毒素 (肉毒杆菌毒素、葡萄球菌肠毒素、破伤风毒素等 )。

猪生殖-呼吸综合征病毒蛋白的结构与功能

猪生殖 -呼吸道综合征 ( PRRS)病毒是新发现的 RNA病毒。其基因组有 8个开放阅读框架 ( ORF) ,ORF1编码病毒的RNA聚合酶 ,ORF2～ 7分别编码糖蛋白GP2～ 5、M蛋白和 N蛋白。本文概括了近几年来国际上对其病毒蛋白的研究成果 ,对这些病毒蛋白的结构。