dalbinol通过ROS/Dvl/GSK-3β/β-catenin信号通路诱导人结肠癌细胞凋亡的作用机制研究

目的探讨天然产物dalbinol对人结肠癌HCT116细胞增殖和凋亡的影响及其作用机制。方法采用MTT法检测dalbinol对人结肠癌HCT116细胞的增殖抑制作用;利用Hoechst 33342荧光染色法观察细胞凋亡的形态学变化;应用流式细胞术检测细胞凋亡率和ROS水平;通过Western blot法检测Wnt/β-catenin信号通路及凋亡相关蛋白的表达情况。结果 dalbinol可抑制人结肠癌HCT116细胞的增殖,且呈剂量和时间依赖性,24、48和72 h的IC50分别为(4.8±0.53)、(2.5±0.43)和(0.6±0.22)μmol·L-1;Hoechst 33342染色观察到细胞皱缩、核固缩和染色质凝集等典型凋亡的形态学变化,同时dalbinol可剂量依赖性地提高细胞凋亡率,且能增加细胞内ROS水平;Western blot结果发现dalbinol通过下调抗凋亡蛋白Bcl-2和Mcl-1的表达水平,上调促凋亡蛋白Bax和Bim的表达,从而促进cleaved caspase-3和cleaved PARP活化裂解,进而诱导细胞凋亡;此外,dalbinol通过抑制Dvl-2和GSK3β(p S9)的蛋白表达,从而降低总的β-catenin和胞核β-catenin的表达,但胞质β-catenin无明显变化,最终下调Wnt/β-catenin通路下游靶蛋白c-Myc和Survivin的表达水平。结论dalbinol可抑制人结肠癌HCT116细胞增殖并诱导其凋亡,其分子机制可能与提高细胞内ROS水平和抑制Dvl/GSK-3β/β-catenin信号通路有关。

半边旗二萜类成分PAG通过ROS诱导肝癌细胞凋亡的作用研究

探讨半边旗二萜类成分Pteisolic acid G(PAG)对人肝癌细胞HepG2增殖和凋亡的影响及作用机制。用不同浓度的PAG处理HepG2细胞后,采用MTT法检测细胞存活率;采用PI单染法检测细胞周期分布;采用Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡率;采用RT-PCR和Western Blotting检测细胞内mRNA和蛋白表达情况;采用DCFH-DA法检测细胞内ROS水平,采用ROS抑制剂乙酰半胱氨酸(NAC)评价PAG细胞增殖抑制作用对ROS的依赖性。结果表明,在24 h、48 h和72 h时,PAG可剂量依赖性地抑制HepG2细胞的增殖(p<0.05),IC_(50)分别为64.8μmol/L,38.5μmol/L和24.8μmol/L;用药24 h时PAG可剂量依赖性地使HepG2细胞阻滞在G_2/M期,同时增加HepG2细胞凋亡率(p<0.05);PAG可剂量依赖性地降低HepG2细胞内Bcl-2 mRNA和caspase 3、PARP、Bcl-2蛋白的表达(p<0.05),增加Bax mRNA和actived-caspase 3、cleaved-PARP、Bax蛋白的表达(p<0.05)。当使用1 mmol/L的ROS抑制剂NAC预处理HepG2细胞时,PAG对HepG2细胞增殖抑制作用被显著阻断。上述结果表明,半边旗二萜类成分PAG可提高Bax/Bcl-2的基因和蛋白表达比值,从而诱导肝癌细胞HepG2凋亡,该作用可能是通过升高细胞内ROS水平来实现的。

12a-羟基明杜西酮通过Wnt/β-catenin信号通路促进人肝癌细胞凋亡的作用研究

为了探讨化合物12a-羟基明杜西酮对人肝癌细胞系Hep G2增殖与凋亡的影响及其作用机制,本研究采用MTT法检测人肝癌细胞系Hep G2的增殖情况;应用流式细胞术检测细胞的周期分布、凋亡率和ROS水平;通过Western Blotting法检测Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白的表达情况。结果表明,化合物12a-羟基明杜西酮可抑制人肝癌细胞系Hep G2的增殖,其抑制率与作用浓度呈时间和剂量依赖性,24 h、48 h和72 h的IC50分别为(12.8±0.67)μmol/L、(8.8±0.43)μmol/L和(6.6±0.42)μmol/L;12a-羟基明杜西酮可剂量依赖性地(5μmol/L、10μmol/L和20μmol/L)使Hep G2细胞阻滞在G2/M期(p>0.05),同时可增加细胞凋亡率(p>0.05),提高细胞内ROS水平(p>0.05)。此外,12a-羟基明杜西酮对Hep G2细胞内总的、细胞质的和细胞核的β-catenin蛋白表达均有降低作用,这说明Wnt/β-catenin通路可能受到了抑制。进一步的研究结果也证实了上述推测:12a-羟基明杜西酮可使Dvl-2、Dvl-3、GSK-3β(p-ser9)、c-myc、survivin的蛋白表达下降,而使GSK-3(p-tyr216)、Axin-2的蛋白表达水平升高,对总的GSK-3β蛋白水平则无明显影响。上述结果表明,化合物12a-羟基明杜西酮可以抑制人肝癌细胞系Hep G2的增殖并诱导其凋亡,其主要作用机制可能与升高细胞内ROS水平和抑制Dvl/GSK-3β/β-catenin信号通路有关。