猪Linda病毒巢式RT-PCR检测方法的建立

猪Linda病毒能引起仔猪先天性震颤,严重危害养猪业的发展,目前在我国暂未发现感染病例。本研究根据猪Linda病毒Core-E~(ms)基因序列,设计并合成巢式RT-PCR引物,通过对退火温度、引物浓度等进行优化,建立了猪Linda病毒巢式RT-PCR检测方法。结果显示,该方法具有良好的特异性,与非洲猪瘟病毒、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病病毒、猪圆环病毒2型均无交叉反应;敏感性好,对慢病毒阳性对照品的最低检出限为10~1 copies/μL,比普通RT-PCR灵敏10倍。使用该方法检测模拟病毒样品,发现最低检出限为10~1 TU/mL,与荧光定量RT-PCR方法一致。本研究首次建立了可检测猪Linda病毒的巢式RT-PCR方法,其特异性强、灵敏度高,为在口岸以及条件有限的场地对猪Linda病毒进行精准且快速的检测提供了有效技术手段,也为防范Linda病毒传入提供了有力技术支撑。

非洲猪瘟病毒CD2v蛋白阻断ELISA候选单克隆抗体的筛选及免疫学特性鉴定

为制备非洲猪瘟病毒CD2v蛋白阻断ELISA候选单克隆抗体,并探究其免疫学特性,以真核表达的CD2v蛋白免疫BALB/c小鼠,经两次免疫后采集小鼠血清,以间接ELISA检测小鼠多抗血清效价。对血清效价最高的小鼠进行加强免疫后,取脾脏进行细胞融合。通过有限稀释法筛选能够稳定分泌CD2v单克隆抗体的杂交瘤细胞株。采用小鼠体内诱生腹水法和辛酸-硫酸铵法获得纯化的CD2v单克隆抗体,对其进行免疫学特性检测。间接ELISA试验显示,4号小鼠血清效价最高(1:72900),选取该小鼠脾脏进行细胞融合,经过筛选得到4株杂交瘤细胞,分别命名为21D10、21G8、36A3和38G8,亚型鉴定均为IgG_(1)/κ,经检测36A3 ELISA效价最高,可达1:2.187×10^(5)。免疫荧光试验显示,36A3抗体能与细胞内表达的CD2v蛋白发生特异性反应,而与携带His标签的p30蛋白无交叉反应;特异性鉴定结果显示,36A3抗体特异性良好,与猪伪狂犬病病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒以及非洲猪瘟病毒p72蛋白均无反应;亲和力检测显示,36A3抗体亲和力较高,亲和常数(Ka)为9.68×10^(8)L/mol。初步建立的阻断ELISA试验显示,36A3能够有效区分阴阳性血清,N/P高达12.53,提示其为非常有效的阻断ELISA候选抗体。本试验结果为深入研究非洲猪瘟病毒CD2v蛋白功能及研发非洲猪瘟病毒阻断ELISA血清学检测试剂盒奠定了基础。

非洲猪瘟病毒p72蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

本研究将含有非洲猪瘟病毒p72全长基因序列的pCMV-p72重组质粒与B602L质粒共同转染HEK293F细胞,纯化获得重组p72-His蛋白,经SDS-PAGE和间接ELISA鉴定后,以该纯化蛋白免疫BALB/c小鼠,进行融合、筛选获得4株单克隆抗体。经亚型鉴定,2B2-1、34C10和22D3均为IgG1/κ型,32H5为IgG2b/κ型,4株单克隆抗体的腹水效价均高于6.4×104。免疫荧光检测结果显示4株单克隆抗体均能够特异性识别ASFV p72蛋白,亲和力试验显示4株单克隆抗体的亲和力由高到低依次为22D3>32H5>2B2-1=34C10,表位竞争试验也揭示这4株单克隆抗体可识别不同的抗原结合位点,且2B2-1和32H5能组成识别抗原的抗体对,34C10单克隆抗体具有竞争效应。所获得的4株杂交瘤细胞株均能够稳定分泌抗体,且分泌的抗体特异性高,亲和力强,有助于进一步研发ASFV血清学诊断方法。

重组酶聚合酶扩增核酸试纸条快速检测诺如病毒方法的建立与应用

旨在建立快速检测GⅠ型诺如病毒的方法与快速检测GⅡ型诺如病毒的方法。分别以GⅠ型NoV特异性保守序列作为靶序列设计并合成RPA引物Nov-GⅠ-F、Nov-GⅠ-R与探针Nov-GⅠ-probe、以GⅡ型NoV特异性保守序列作为靶序列设计并合成RPA引物Nov-GⅡ-F、Nov-GⅡ-R与探针Nov-GⅡ-probe,利用RPA检测试剂盒建立RPA扩增体系,并通过核酸检测试纸条对扩增产物进行分析鉴定。通过检测不同拷贝数的重组GⅠ型NoV阳性质粒对GⅠ型NoV快速检测方法的灵敏度进行评价,通过检测不同拷贝数的重组GⅡ型NoV阳性质粒对GⅡ型NoV快速检测方法的灵敏度进行评价,并与普通PCR方法和实时荧光PCR方法进行比较;以星状病毒、MS2噬菌体基因组、人轮状病毒和人腺病毒重组质粒作为模板对GⅠ型NoV快速检测方法与GⅡ型NoV快速检测方法的特异性进行评价;应用建立的两种方法对市场上采集的20份食品样品进行GⅠ型NoV检测与GⅡ型NoV检测。GⅠ型NoV快速检测方法与GⅡ型NoV快速检测方法检测到最低质粒拷贝数均为101 copies/μL,且两种检测方法对其余病毒均具有良好特异性;对于从市场采集的潜在携带NoV的食品样品进行检测,结果均为阴性。本研究建立的针对GⅠ型NoV快速检测方法与GⅡ型NoV快速检测方法相较于普通PCR与实时荧光PCR具有检测时间短、特异性强、灵敏度高以及检测操作简单快捷的优点,更适用于市场流通领域食品及医学检测等现场快速检测的应用。

进境陆生动物多指标风险评估模型的建立

为有效提高进境陆生动物风险评估的客观性和科学性,基于层次分析(analytic hierarchy process,AHP)法,根据世界动物卫生组织(WOAH)风险评估基本原则,同时结合生物安全管理及生物多样性,总结了陆生动物进境“境外、口岸、境内”环节中传带疫病的风险因素,构建了进境陆生动物多指标风险评估模型,通过专家对指标赋分后量化加权计算出进境陆生动物最终风险值,从而实现了针对进境陆生动物的半定量风险评估。该模型的建立对提高动物疫病风险分析技术水平具有借鉴意义。

进口俄罗斯牛肉传入牛结节性皮肤病风险评估

依照世界动物卫生组织《陆生动物卫生法典》中的动物及动物产品进境风险分析框架,采用定性评估方法,对俄罗斯输华牛肉开展牛结节性皮肤病传入风险评估。评估认为,在不采取检疫监管措施的情况下,牛结节性皮肤病随俄罗斯进口牛肉传入的风险为“中”,暴露风险为“低”,后果风险为“高”,综合风险为“中”。由此,建议采取产地牛源控制、疫源监测检测以及加强宰前宰后检验和牛肉进口检疫监管等措施,防范牛结节性皮肤病随俄罗斯牛肉进口传入我国。

进境动物及动物产品传带SAT型口蹄疫的风险评估

SAT型口蹄疫(foot and mouth disease,FMD)已从传统流行区域非洲大陆传播至西亚、中东地区,对我国畜牧业发展构成了潜在威胁。为评估SAT型FMD跨境传入风险,采用定性评估方法,对进境动物及动物产品传带SAT型FMD的风险进行了综合评估。结果表明,从疫区进口相关动物及动物产品传入SAT型FMD的风险高,因此需采取严格的风险管理措施,将FMD传入风险降低至我国可接受的水平。

尼帕病毒病的风险分析与防控措施

从生物安全等级上来说,尼帕病毒病属于第四级病毒,非常危险,包括人在内的多种动物均可被感染,该病毒毒力强,死亡率高,后果严重,因此本文针对尼帕病毒病的风险及其防控措施进行了探讨。

西班牙牛精液输华传带施马伦贝格病毒的风险评估

随着我国与西班牙反刍动物遗传物质(精液)贸易的日益频繁,施马伦贝格病毒存在随精液传入我国的潜在风险,从而对我国动物卫生安全构成了威胁。本研究采用定性评估方法,基于世界动物卫生组织(OIE)风险评估框架,对施马伦贝格病的病原学、流行病学、公共卫生学意义、诊断技术的最新研究进展进行简要综述,在此基础上,从畜群疫病流行风险、精液带毒风险、带毒精液漏检风险3个方面,对产自西班牙的牛精液传带施马伦贝格病毒的风险进行综合评估。评估结果表明,通过采取适当的风险管理和检疫措施,可以将西班牙牛精液传带施马伦贝格病毒风险降低为"低"。

中外动物卫生技术性贸易措施标准比较及建议

为了明确我国动物卫生领域面临的主要技术性贸易壁垒,本文研究国际动物卫生技术性贸易措施与规则修订趋势,寻求我国标准化方面破解和规避技术性贸易措施的对策,助力动物及动物产品国际贸易健康发展,对国际组织和主要贸易国动物卫生领域技术性贸易措施相关规则和标准进行了收集分析。通过研究和比较,总结了国际动物卫生技术性贸易措施与规则修订趋势,在国家标准化层面提出了破解、应对国外技术性贸易措施以及提高我国动物卫生标准化水平的建议。

日本核泄漏污染俄罗斯输华鱼粉的风险评估

2011年3月11日日本本州岛海域发生地震，日本福岛第一核电站发生核燃料泄漏，大量放射性物质泄漏至环境中。因此，为了保护国内民众不受日本核泄露事件带来的危害，对俄罗斯输华鱼粉进行风险评估。经分析，核泄漏发生70-75d后，俄罗斯捕捞船作业区将受到较明显的核污染影响。建议限制俄罗斯输华鱼粉的作业捕捞作业范围，处于风险区之内的全面禁止向中国出口鱼粉，并进一步加强风险评估工作。

欧洲暴发施马伦贝格病疫情及我国应采取的对策

2011年夏秋季节,德国和荷兰一些牛场开始出现一种未知疾病,病牛出现发热（〉40℃）、精神不振、体质下降、厌食、产奶量下降（高达50%）和腹泻等临床症状,有时出现流产症状,但多数症状出现数天后自动消失^[1-2]。德国弗里德里希洛弗勒研究所（Friedrich Loffler Institute,FLI）通过实验室诊断,先后排除了蓝舌病、流行性出血热、口蹄疫、裂谷热、牛病毒性腹泻、牛流行热、牛疱疹病毒1型感染以及其他疱疹病毒感染的可能。

水牛乳和荷斯坦牛乳中五种常量元素含量的测定

对摩本杂水牛（摩拉水牛×德宏水牛）乳和荷斯坦牛乳中的5种常量元素进行测定。采用火焰光度法测定钾、钠含量,火焰原子吸收分光光度法（FAAS）测定钙、镁含量,磷钼酸比色法测定磷含量。结果表明,水牛乳中钾、钠含量极显著低于荷斯坦牛乳（P〈0.01）,钙、磷含量极显著高于荷斯坦牛乳（P〈0.01）,两种牛乳中镁含量差异不显著（P〉0.05）。元素测定相对标准偏差（RSD）低于5%,平均加标回收率在95.05%～105.18%之间。

赤羽病研究概况

赤羽病是由赤羽病病毒引起的一种虫媒传染病,该病在热带和温带的许多国家和我国大部分地区广泛流行,给世界畜牧业造成了巨大的经济损失。赤羽病毒属于布尼病毒科布尼病毒属辛波血清群,主要通过吸血昆虫(如蚊和库蠓)叮咬易感反刍动物进行传播,怀孕绵羊、山羊和牛最易感,临床上以流产、早产、死胎和先天性畸形为特征。论文对赤羽病病原学、流行病学、发病机制与病理变化、诊断及防控措施等方面的进展进行综述,以期为预防控制赤羽病的发生和流行提供参考。

非洲猪瘟病毒p54蛋白的表达及单抗制备

为制备非洲猪瘟病毒p54蛋白的单克隆抗体,本研究扩增p54蛋白的胞外区编码基因,分别克隆到p ET30a和p GEX-6p-1中,构建了p54-p ET30a和p54-p GEX-6p-1重组质粒;将质粒分别转化到大肠杆菌BL21中,表达C末端带6个His、N端带有GST的p54重组蛋白;利用亲和层析的方法,富集和纯化带His标签的p54蛋白;以带His标签的p54蛋白为抗原,免疫BALB/C小鼠,制备单克隆抗体;以带有GST标签的p54蛋白为抗原,对制备的单抗进行特异性验证。结果显示:大肠杆菌能高效表达带His标签和GST标签的非洲猪瘟p54蛋白;His标签的p54蛋白免疫BALB/C小鼠后,得到了3株单克隆抗体;Western blot结果表明,3株单克隆抗体能与带有GST标签的p54蛋白相互反应。本研究成功制备了p54的单克隆抗体,为进一步开展非洲猪瘟ELISA、Western blot和细胞免疫荧光检测技术的开发研究奠定了基础。

转人溶菌酶基因奶牛多重PCR快速检测方法的建立

建立转基因奶牛多重PCR快速检测方法,为转基因动物及产品进出境检测技术平台的建立提供技术支持,并为转基因动物及产品检测技术标准的制定提供参考。根据牛物种特异性基因线粒体DNA(mitochondrial DNA,mtDNA)设计奶牛内源性基因引物,根据外源基因人溶菌酶基因(human lysozyme,hLY)及标记基因新霉素磷酸转移酶基因(NPTⅡ)设计特异性引物,优化反应条件,建立转基因奶牛多重PCR检测方法。结果表明,建立的方法灵敏、快速、特异,一个反应可以检测多个基因片段,可有效用于转基因奶牛外源基因的检测。

可诱导表达小反刍兽疫病毒P蛋白细胞系的建立

为研究小反刍兽疫病毒(PPRV)磷蛋白(P)的生化功能,本研究通过PCR将PPRV p全长基因扩增后克隆至真核表达载体pcDNA4/TO中,构建了重组质粒pcDNA4/TO-PPRVP。将该质粒转染至已稳定转入pcDNA6/TR质粒的T-REx293细胞中,并用博来霉素和稻瘟菌素筛选存活克隆。将强力霉素添加至存活细胞克隆中诱导P蛋白表达,Western blot及间接免疫荧光试验鉴定出可诱导表达P蛋白的细胞克隆,扩增阳性克隆获得能够稳定表达P蛋白的细胞系。Western blot显示该细胞系表达的P蛋白能够与山羊PPRV阳性血清反应,并能够有效抑制聚肌胞苷酸诱导的STAT1磷酸化,表明该细胞系表达的重组PPRV P蛋白具有与野生型P蛋白类似的生物活性。本研究利用Tet on系统建立了表达PPRV P蛋白的真核细胞系,为深入研究PPRV的致病机制奠定了基础。

肌肉生成抑制素基因敲除猪多重PCR检测方法的建立

[目的]本试验旨在建立肌肉生成抑制素基因(myostatin,MSTN)敲除猪的快速检测方法,为该品系转基因猪及其产品的检测提供技术支持。[方法]根据猪β2-微球蛋白基因(β2-microglobulin,B2M)设计猪内源性基因引物,标记基因新霉素磷酸转移酶基因(neomycin phosphotransferaseⅡ,NPTⅡ)和测定的边界序列设计特异性引物,对引物的量进行调整,优化反应条件。对PCR的敏感性和特异性进行检测,并应用建立的方法对随机选取的32份猪肺和脾脏组织样品进行检测,均仅扩增出B2M条带。[结果]该方法的最佳退火温度为56℃,最低能检测出含1%MSTN基因敲除基因组成分的样本,对32份组织样本仅扩增出B2M条带。[结论]建立的多重PCR方法敏感、特异,在一个反应中能检测多个基因片段,可用于MSTN基因敲除猪的检测,为此品系转基因动物检测标准的建立提供依据。

基于专家问卷系统建立动物疫病半定量风险评估技术

为使动物疫病传播风险评估工作更加科学,在现有条件下尽量减少人员主观因素给风险评估带来的不良影响,从而有效提高动物卫生风险分析水平,在定性风险评估原则基础上,构建了基于专家问卷系统(experts questionnaire system,EQS)的动物疫病半定量风险评估模型。该评估模型利用层次分析法(analytic hierarchy process,AHP),把专家对动物疫病传入的定性风险评估结果进行量化加权,将定性评估转化为半定量评估。在风险评估时,该系统将专家对相关领域的熟悉程度也进行量化处理,从而提升了风险打分的合理性。本研究建立的半定量风险评估模型,提高了定性风险评估结论的准确性和可重复性,同时结合了专家对于专业知识的把握程度,很好地解决了定性风险评估科学性和客观性不足的问题,能够从实际应用层面提升动物疫病风险分析水平,使我国动物疫病风险管理模式更加科学、合理、高效。

从进口动物检疫角度推进奶业供给侧结构性改革

随着我奶业结构调整和产业升级,对进口优质奶牛和牛遗传物质的需求旺盛,从畜牧业发达国家进口奶牛数量显著增加。我国年均进口奶牛约17万头,澳大利亚、新西兰是主要进口活牛来源国。2014—2016年,共检疫进口奶牛535 367头,淘汰不合格奶牛138 660头,淘汰率为25.9%。澳大利亚、新西兰作为传统畜牧业发达国家,动物疫病防控水平优良,国家兽医体系完善,奶牛品质优秀;智利作为扩种引源新开设的引种目的国,整体情况良好;乌拉圭的国家动物防疫体系有待提高。牛的遗传物质进口近年来稳中有升,美国、加拿大是主要进口目的国。建议通过扩种引源提升进口企业议价空间,改良和扩充我国奶牛种群基因库;通过原产地预检工作,确保进境奶牛的健康和品质;对进口动物检疫制度进行优化,合理配置检疫资源,提升检疫效率,在风险可控的情况下促进畜牧业贸易便利;通过简政放权和释放政策红利的方式为企业减负。