苏木化在心肌缺血再灌注损伤中的作用及机制研究进展

心肌梗塞(MI)是一种普遍存在且危及生命的心血管疾病。心肌缺血/再灌注(MI/R)损伤对心肌梗塞患者的预后有很大影响。最近,有人发现小泛素样修饰(SUMO)蛋白可以形成一种新的蛋白质翻译后修饰(PTM),称为苏木化,在MI/R损伤中发挥显著作用。此外,已发现几种可以被苏木化的靶蛋白会干扰MI/R损伤的不同机制,在MI/R损伤中具有保护作用。因此,更好地理解苏木化在心肌缺血再灌注损伤中的作用及机制,有利于开发更有效的治疗心血管疾病的靶向药物。

人参皂苷Rg3对大鼠血管平滑肌细胞凋亡及凋亡相关基因表达的影响

目的研究人参皂苷Rg3(Ginsenoside Rg3,GSRg3)对大鼠血管平滑肌细胞(Vascular smooth muscle cells,VSMCs)凋亡的影响及可能的作用机制。方法采用组织块贴壁法培养大鼠VSMCs,免疫荧光法检测VSMCs中平滑肌α-肌动蛋白(Smooth muscle alpha actin,SMα-actin);MTT法检测不同浓度GSRg3(25、50、100μg/mL)和不同时间(24、48 h)刺激下对VSMCs的增殖效应;Annexin V-FITC/PI双标记流式细胞术检测GSRg3处理VSMCs凋亡情况;Western blot检测Bax、Bcl-2、cleaved caspase 3、cleaved caspase 9蛋白的表达水平。结果MTT检测结果显示,与对照组相比,不同浓度GSRg3组VSMCs增殖活性下降,且呈时间和剂量依赖性(P<0.05);Annexin V-FITC/PI双标记流式细胞术检测结果显示,与对照组相比,不同浓度GSRg3作用于VSMCs 48 h后凋亡率明显增加(P<0.05);Western blot结果显示,与对照组相比,GSRg3能够下调抗凋亡蛋白Bcl-2的表达,上调促凋亡蛋白Bax、cleaved caspase 3和cleaved caspase 9的表达,并呈浓度依赖性(P<0.05)。结论GSRg3通过促进Bax、cleaved caspase 3和cleave caspase 9的表达,抑制Bcl-2的表达,从而诱导VSMCs凋亡。

骨髓源性生长因子对高糖诱导H9c2细胞焦亡的改善作用

目的探讨骨髓源性生长因子(myeloid-derived growth factor,Mydgf)是否通过调控NLRP3改善高糖诱导的心肌细胞焦亡。方法培养大鼠心肌细胞株H9c2,实验分为4组:(1)正常组(normal,Nor)为正常培养的H9c2细胞;(2)高糖组(high glucose,HG)予以50 mmol/L葡萄糖干预H9c2细胞24 h;(3)Mydgf组采用25 ng/mL重组Mydgf蛋白处理细胞12 h,随后以50 mmol/L葡萄糖干预H9c2细胞24 h;(4)Necrosulfonamide组(NSA)采用32μmol/L NSA处理细胞0.5 h,然后予50 mmol/L葡萄糖干预H9c2细胞24 h。Western blot法检测H9c2细胞中天冬氨酸蛋白水解酶剪切体-1(cleaved Caspase-1)、凋亡相关斑点样蛋白(ACS)、炎症复合体(NLRP3)及成孔蛋白gasdermin D(GSDMD)的表达水平。ELISA法检测细胞培养液中IL-1β和IL-18的分泌量。CCK-8法检测Mydgf及NLRP3对H9c2细胞活力的影响。将携带NLRP3的增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)慢病毒载体(NLRP3-EGFP)及空病毒载体(EGFP)分别转染至H9c2细胞,做回复实验,检测焦亡相关指标变化。结果Western blot结果显示,HG组焦亡相关蛋白cleaved Caspase-1、ACS、NLRP3、GSDMD表达量较正常组明显增高(P<0.05),Mydgf处理后,焦亡相关蛋白的表达受到明显抑制(P<0.05),但抑制效率低于NSA组(P<0.05)。ELISA检测结果表明炎症相关指标IL-1β和IL-18在HG组中表达增高(P<0.05),而在Mydgf组中表达下降(P<0.05),NSA组明显下降(P<0.05)。CCK-8法检测结果表明<25 ng/mL的Mydgf对H9c2细胞活力无明显影响,>25 ng/mL的Mydgf明显降低H9c2细胞活力(P<0.05)。与对照组相比,过表达NLRP3使HG条件下的细胞活力明显下降。EGFP慢病毒转染NLRP3至H9c2细胞中,RT-qPCR及Western blot结果发现EGFP组中NLRP3的mRNA及蛋白表达与正常组差异无统计学意义(P>0.05),而NLRP3-EGFP组中NLRP3的mRNA及蛋白表达均显著增高(P<0.05)。回复实验的Western blot结果显示,在高糖环境中,与Mydgf组相比,Mydgf+NLRP3-EGFP组中焦亡相关蛋白NLRP3、ASC、cleaved Caspase-1表达显著增加(P<0.05);ELISA检测结果也表明IL-1β和IL-18表达较Mydgf组明显增高(P<0.05)。结论Mydgf可能通过抑制NLRP3来改善高糖诱导的心肌细胞焦亡。

TLR4基因修饰BMSCs移植对大鼠急性心肌梗死后心功能的影响

目的探讨Toll样受体-4(Toll-like receptor 4,TLR4)修饰的骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem Cells,BMSCs)对心肌梗死后心脏心功能的影响。方法取大鼠骨髓体外分离扩增培养BMSCs,将携带目的基因重组慢病毒载体(Lv-EGFP-TLR4)及空病毒载体(Lv-EGFP)分别转染至BMSCs;用ELISA检测Lv-EGFP-TLR4转染后BMSCs细胞上清液TLR4的表达。选用成年SD大鼠,结扎左冠状动脉前降支建立急性心肌梗死模型,随机分为3组(n=18):对照组、Lv-EGFP-BMSCs组、Lv-EGFP-TLR4-BMSCs组。分别将Lv-EGFP-BMSCs和Lv-EGFP-TLR4-BMSCs多点注射到大鼠心肌梗死区周边,对照组注射等量PBS;细胞移植第7天,用荧光显微镜追踪EGFP阳性细胞表达,Western blot检测梗死区周边TLR4的蛋白表达;细胞移植第28天,用超声心动图检测大鼠心功能,HE和MASSON染色观察心肌胶原纤维化程度,用ELISA检测血清Ⅰ型前胶原羧基端肽(PⅠCP)和Ⅲ型前胶原氨基端肽(PⅢNT)表达水平。结果Lv-EGFP-TLR4转染BMSCs后,细胞上清液中TLR4的表达明显增多,浓度达到(31.55 pg/mL)。细胞移植第7d,心肌梗死区域有EGFP标记的BMSCs,Lv-EGFP-TLR4-BMSCs组的绿色荧光强度明显优于Lv-EGFP-BMSCs组,对照组无EGFP表达,TLR4蛋白表达也明显高于Lv-EGFP-BMSCs组(P<0.01)。细胞移植第28 d,Lv-EGFP-TLR4-BMSCs组左室射血分数[LVEF(44.36±5.62)%]和短轴缩短率[LVFS(22.88±9.89)%]较Lv-EGFP-BMSCs组[LVEF(18.41±5.66)%,LVFS(18.41±5.66)%]均明显增加(P<0.01),左心室收缩末径[LVDs(5.41±0.71)]和左心室舒张末径[LVDd(7.11±0.79)]值较Lv-EGFP-BMSCs组[LVDs(6.66±0.91),LVDd(8.06±0.96)]均明显缩小(P<0.01);血清中Lv-EGFP-TLR4-BMSCs组PⅠCP(72.88μg/L)和PⅢNP(7.33μg/L)蛋白浓度较Lv-EGFP-BMSCs组[PⅠCP(83.79μg/L)和PⅢNP(9.51μg/L)]减少(P<0.05);Lv-EGFP-TLR4-BMSCs组心肌纤维化程度也明显低于Lv-EGFP-BMSCs组。结论TLR4基因修饰BMSCs移植治疗心肌梗死,进一步减轻心肌纤维化程度,从而改善心肌梗死大鼠的心功能。

假单胞菌单加氧酶基因的克隆表达及其在手性亚砜生物催化合成中的活性分析

单加氧酶催化的硫醚底物不对称氧化反应是手性亚砜类药物绿色合成的新途径之一,而寻求高催化效率和高底物耐受性的硫醚单加氧酶仍是其难点和瓶颈。本研究从前期获得的能高效合成手性亚砜化合物的菌株中筛选和克隆了2个单加氧酶基因,构建相应的表达载体并诱导表达重组蛋白,最后以苯甲硫醚为底物来初步探讨重组蛋白在生物催化合成苯甲亚砜中的活性。结果显示,成功构建了2个基因的表达载体并获得了大量的可溶性重组蛋白。而且,这2个重组蛋白均表现出了一定的生物催化活性,能将少量的苯甲硫醚底物转化为苯甲亚砜产物。本研究为将来进一步利用重组酶蛋白生物催化合成手性亚砜类化合物打下了一定的基础。

Mst-1调控缺氧复氧诱导的小鼠心肌细胞自噬及凋亡的机制

目的探索小鼠心肌细胞中哺乳动物不育系20样激酶1(mammalian sterile 20-like kinase 1,Mst-1)调控缺氧复氧(hypoxia reoxygenation,HR)诱导的心肌细胞自噬及凋亡机制。方法采用酶消化法结合差速贴壁的方法培养小鼠乳鼠心肌细胞,通过缺氧24 h复氧6 h的方法建立HR模型。实验分组:对照组:正常培养的心肌细胞;Mst-1空病毒组:用重组慢病毒空载体转染心肌细胞48 h;Mst-1敲低组:用携带Mst-1小干扰RNA(siRNA)的重组慢病毒转染心肌细胞48 h;Mst-1过表达组:用携带Mst-1基因的重组慢病毒转染心肌细胞48 h;HR组:建立心肌细胞HR模型;Mst-1敲低+HR组:用携带Mst-1 siRNA的重组慢病毒转染心肌细胞后48 h建立心肌细胞HR模型;Mst-1过表达+HR组:用携带Mst-1基因的重组慢病毒转染心肌细胞后48 h建立心肌细胞HR模型。采用实时荧光定量RCR(qPCR)以及Western blot检测细胞中Mst-1 mRNA及蛋白相对表达量,免疫荧光染色检测心肌细胞标志物心肌肌钙蛋白T(cTnT),及细胞自噬体与自噬溶酶体变化,脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记(TUNEL)法检测心肌细胞凋亡水平,Western blot检测自噬相关蛋白微管相关蛋白1轻链3(LC3)Ⅱ/LC3Ⅰ,P62及凋亡相关蛋白半胱氨酸天冬氨酸酶剪切体(cleaved-caspase)9、半胱氨酸天冬氨酸酶前体(pro-caspase)9、cleaved-caspase-3、pro-caspase-3,以及髓细胞白血病1基因(MCL-1)的表达情况达。予以MCL-1抑制剂A1210477做回复实验,验证Mst-1通过调控MCL-1参与心肌细胞凋亡及自噬。结果免疫荧光检测发现培养细胞表达心肌细胞特异性标志物cTnT;HR情况下心肌细胞中Mst-1表达增加,慢病毒转染可有效抑制或过表达细胞中Mst-1。HR组与Mst-1过表达+HR组心肌细胞内自噬体及自噬溶酶体含量低于对照组,而Mst-1敲低+HR组心肌细胞内自噬体及自噬溶酶体含量高于HR组(P均<0.05)。TUNEL结果显示,HR组及Mst-1过表达+HR组中TUNEL阳性细胞比例高于对照组,而Mst-1敲低组+HR组中TUNEL阳性细胞比例低于HR组(P均<0.05)。Western blot结果显示,与对照组比较,HR组及Mst-1过表达+HR组细胞中LC3Ⅱ/LC3Ⅰ值较低,P62与cleaved-caspase-9、cleaved-caspase-3表达水平较高(P均<0.05);与HR组比较,Mst-1敲低+HR组中LC3Ⅱ/LC3Ⅰ值较高,P62与cleaved-caspase-9、cleaved-caspase-3表达水平较低(P均<0.05)。HR与Mst-1过表达+HR组心肌细胞中磷酸化(P)MCL-1蛋白表达水平低于对照组,Mst-1敲低+HR组的P-MCL-1蛋白表达水平高于HR组(P均<0.05)。回复实验显示抑制细胞中MCL-1可阻断Mst-1 siRNA对细胞自噬及凋亡的调节作用。结论抑制心肌细胞中Mst-1的表达,可促进HR诱导的心肌细胞自噬,改善心肌细胞凋亡,该作用可能与其调控MCL-1表达相关。