诺如病毒NV衣壳蛋白VP1表达纯化及多克隆抗体的制备

目的获得纯化的诺如病毒(NV)衣壳蛋白VP1,免疫动物制备多克隆抗体。方法提取粪便样品中诺如病毒RNA,逆转录得到cDNA文库,通过PCR扩增获取VP1基因序列,构建到大肠埃希菌原核表达系统中诱导表达重组VP1蛋白。使用镍柱亲和层析法对重组蛋白进行纯化,十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和考马斯亮蓝法(BSA)对重组蛋白的纯度与浓度进行分析,以重组的VP1蛋白为抗原,免疫雄性SPF级SD大鼠获得多抗血清,用ELISA测定抗体效价、Western blot检测抗体特异性。结果成功地构建出重组表达载体VP1-pET28a,并将其在大肠埃希菌BL21(DE3)中稳定地表达诱导重组蛋白。ELISA测其多抗血清的平均效价为1∶200 000,Western blot检测抗体在原核和真核特异性很高。结论本实验成功地利用原核表达系统表达诺如病毒衣壳蛋白VP1,为进一步研究诺如病毒的诊断和疫苗开发提供了条件。

柯萨奇病毒B组5型非结构蛋白3C表达纯化及多克隆抗体的制备

目的 表达和纯化柯萨奇病毒（CVB5）非结构蛋白3C,免疫雄性大鼠制备多克隆抗体.方法 通过酶切质粒获取3C基因序列,构建到原核表达系统大肠埃希菌中诱导表达重组的3C蛋白,使用镍柱亲和层析法纯化重组蛋白,十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和考马斯亮蓝染色法（BSA）对重组蛋白的纯度与浓度进行分析,重组的3C蛋白作为抗原,免疫雄性SPF级大鼠获得多抗血清,用ELISA测定抗体效价并Western印迹检测抗体特异性,用该抗体检测病毒在细胞内的复制.结果 构建了重组表达载体命名为3C-pET-28a,并在大肠埃希菌BL21（DE3）中诱导表达重组3C蛋白.ELISA测定制备的多抗血清效价为1：500 000,Western印迹检测在EV71、CVA16中都有交叉反应,并确定病毒感染细胞后24 h开始复制.结论 实验成功地利用原核表达系统表达柯萨奇病毒非结构蛋白3C,为进一步研究柯萨奇病毒的感染机理以及疫苗制备提供了基础.

复制器：促进病毒在感染细胞内复制的一种“细胞器”

某些正链RNA病毒感染细胞之后，重塑了宿主的细胞内膜，使内膜环境发生改变，形成了专门促进病毒复制的细胞器称为复制器。它是由病毒的非结构蛋白招募特定的细胞蛋白在细胞内膜上形成病毒复制复合物，并在复制器的膜表面作为复制结合位点进行病毒的复制、组装等。文章主要从复制器的结构，病毒复制过程中的功能及其作用机制进行讲述，为进一步研究病毒感染机制提供了参考。

产气肠杆菌组成型启动子的筛选及其活性测定

目的：从产气肠杆菌基因组中筛选组成型启动子，并检测其活性。方法用Sau3 AⅠ限制性内切酶将产气杆菌的基因组酶切到500 bp大小，连接到pCMR8 a载体上，转化DH5α感受态后涂布氯霉素和卡那抗生素的双抗平板上筛选启动子，经SDS－PAGE分析启动子的蛋白表达能力，筛选较强启动子并对其进行截短和顺反性实验，最后利用截短启动子表达不同的蛋白。结果成功筛选到了5个启动子序列，获得到了表达能力最强启动子的截短核心序列，验证了其具有反向启动外源蛋白表达的能力，成功表达了其他外源蛋白。结论本实验通过大肠埃希菌表达系统成功的筛选并验证了产气杆菌的一种组成型启动子，具有较强的启动外源蛋白表达能力，对工业上蛋白的生产及实验室表达某种蛋白具有重要意义。