去泛素化酶Otulin基因心内膜敲除小鼠模型的构建及表型初步分析

目的构建心内膜条件性敲除去泛素化酶Otulin基因小鼠模型,初步分析该模型小鼠的表型。方法Cre?loxP重组技术构建心内膜条件性Otulin基因敲除小鼠模型;PCR技术明确Otulin基因敲除小鼠的基因型;统计分析敲除小鼠出生情况并观察其生长发育状态:超声监测小鼠心脏功能,全自动血液分析仪测定血液中细胞组分变化,苏木素?伊红(HE)染色评价小鼠各器官组织的病理改变。结果心内膜特异性Otulin基因敲除小鼠模型成功构建;该条件性敲除小鼠可正常交配繁殖,子代基因型比例遵循孟德尔遗传定律;与同窝对照小鼠相比,该条件性敲除小鼠体型较小,体重减轻,脾明显肿大,血液中的炎性细胞数量显著增加,并且心脏组织三尖瓣缺损,心功能衰减。结论成功构建心内膜特异性Otulin基因敲除小鼠模型,该模型小鼠心脏功能受损且有明显的炎症反应。

泛素链修饰类型研究进展

泛素化修饰的蛋白质底物广泛参与蛋白质降解、胞内蛋白质转运、细胞信号转导、自噬和DNA损伤修复等重要的生物学过程。泛素化修饰包括单泛素化修饰和多泛素化修饰。因泛素分子含有7个赖氨酸残基和1个N端甲硫氨酸残基,多泛素化修饰又可分为同型或异型的多聚泛素化修饰。此外,泛素分子的乙酰化修饰和磷酸化修饰大大增加了泛素链的复杂性。不同泛素链的形成往往依赖泛素连接酶或者去泛素化酶。现综述不同类型的泛素链修饰类型的编辑、识别、去除机制及其生物学功能,并讨论泛素分子自身的乙酰化和磷酸化修饰。

应用CRISPR/Cas9技术构建YOD1基因敲除小鼠

目的：应用CRISPR/Cas9技术构建去泛素化酶YOD1基因敲除小鼠。方法：针对YOD1基因设计单链向导RNA（sg RNA）识别序列,构建sg RNA质粒,与Cas9质粒体外转录、纯化后注射入受精卵,通过PCR和测序验证得到F0代阳性小鼠。配繁两代后,取同窝对照的野生型（WT）和敲除（KO）小鼠的主要组织器官研磨,使用免疫印迹（WB）技术检测各组织YOD1蛋白的表达,确证YOD1敲除小鼠模型是否成功建立。统计YOD1杂合子（HET）自交存活后代各基因型比例,分析是否有胚胎致死表型。解剖小鼠分析主要组织器官的表型,进一步利用H.E.染色分析KO小鼠是否存在自发的病理改变。通过血糖耐受实验（GTT）分析KO小鼠的血糖调控能力。结果：基因组测序和WB检测结果显示KO小鼠中YOD1被明显敲除,YOD1敲除小鼠模型成功建立。YOD1杂合子自交后代各基因型比例符合孟德尔定律,提示KO小鼠非胚胎致死。YOD1敲除小鼠肝脏显著小于WT小鼠。GTT结果表明敲除YOD1不影响小鼠的血糖稳态。结论：应用CRISPR/Cas9技术成功构建YOD1基因敲除小鼠。KO小鼠正常出生,无任何胚胎发育缺陷。与WT小鼠相比,KO小鼠肝脏显著减小,但无显著的自发病理变化,KO小鼠血糖控制亦无显著差异。

不同尾吊时间对失重模拟小鼠心脏功能的影响研究

目的探究不同尾吊(TS)时间下失重模拟小鼠心脏功能变化。方法将30只小鼠随机分为3组:对照(CTRL)组、40 d尾吊(TS⁃40 d)组、70 d尾吊(TS⁃70 d)组。尾吊结束后,利用称重、心脏超声、苏木精⁃伊红(HE)染色和Masson染色法、实时定量PCR(qPCR)方法评价失重模拟小鼠的心脏功能。结果与CTRL组小鼠相比,TS组小鼠体重增长缓慢(P<0.01);心脏超声显示,TS⁃40 d组小鼠射血分数、缩短分数较CTRL组显著下降(P<0.05);TS⁃70 d组小鼠射血分数和缩短分数相较TS⁃40 d组显著上调。心脏形态学和质量数值显示,TS组较CTRL组心肌萎缩(P<0.0001);HE和Masson染色结果显示,TS组小鼠心脏胶原纤维呈蓝色,TS⁃70 d组更明显;qPCR结果显示,TS组较CTRL组小鼠心脏重塑因子脑尿钠肽(BNP)和纤维化标志物间质金属蛋白酶2(MMP2)表达上调,TS⁃70 d组更显著。结论TS⁃40 d小鼠心脏功能下降,心脏萎缩、纤维化;TS⁃70 d小鼠心脏功能出现适应性恢复,但出现更严重的萎缩和纤维化。

新型小鼠闭合型骨折造模仪的制作与模型评价

目的设计发明一种新型骨骼击打装置,并优化髓内针固定手术方案,建立用于骨折愈合机制研究及骨折治疗药物评价的标准闭合型小鼠股骨骨折模型。方法自主设计针对小鼠的骨折击打装置,精确控制击打能量,并采用以击打导线替代直接击打髓内针的方式对小鼠进行造模。术后通过影像学、组织学、分子生物学等方法评估骨折愈合进程。结果将120 g重物从200 mm高处下落击打小鼠股骨干,通过X线证实在30只实验小鼠中,有26只为横形或斜形骨折,造模成功率86.667%。术后通过X线观察、micro-CT分析、组织化学染色和qPCR检测标志基因等技术判断小鼠骨折愈合的方式为软骨内成骨,愈合过程与文献报道一致。结论自行设计的骨折造模仪操作简单、控制精确,可成功建立稳定、可重复的小鼠股骨闭合型髓内针固定的骨折模型,用于骨折愈合的基础及临床转化研究。