Sirt1基因稳定低表达的LMH细胞系构建

为构建Sirtl基因低表达的LMH细胞系,根据鸡Sirtl基因的3′UTR序列设计gSmiR30、gSmiR70和gSmiR913个miRNAs,以质粒pLNCX-gSmiRn(n为30,70或91)分别过表达这3个miRNAs48h后,依次检测其对CHO-K1细胞中报告载体psiCHECH2-gSirtl-UTR672所表达的荧光素酶活性的影响以及对LMH细胞中Sirtl基因表达的干扰情况;然后选用干扰效果较好的pLNCX-gSmiR30包装的反转录病毒感染LMH细胞,以终浓度1μg·mL^-1的G418筛选稳定过表达gSmiR30的LMH-gSmiR30细胞系,荧光定量PCR和Westernblot检测Sirtl基因的表达。结果表明:人工设计的3个miRNAs可抑制含靶位点的海肾荧光素酶活性在97%以上;且LMH细胞中Sirtl的mRNA表达水平均能被这3个miRNAs下调40%以上;筛选得到的LMH-gSmiR30细胞中绿色荧光蛋白的表达率在99%以上,细胞内Sirt1基因的mRNA水平下降75%,SIRT1蛋白也明显减少。这一研究成功获得了Sirt1基因低表达的LMH-gSmiR30细胞系,为进一步研究Sirt1基因在鸡肝脏中的功能提供了一种很好的细胞模型。