(鱼央)属4种鱼SRY、SOX和HOX基因同源序列的PCR扩增分析

选用根据人类SRY基因HMG保守区序列、HMG-box序列以及HOX基因保守序列设计的3对引物,分别对白缘(Liobagrus marginatus)、大拟缘(Liobagrus marginatoidesW u(b ig))、小拟缘(Liobagrus margina-toidesW u(sm all))、黑尾(Liobagrus nigricauda)4种鱼的雌雄基因组进行了PCR扩增。结果在4种鱼的雌雄基因组中发现1个1 200 bp左右的SRY基因同源序列片段,3个分别为200 bp、500 bp和1 200 bp左右的SOX基因同源序列片段,2个分别为150 bp和200 bp左右的HOX基因同源序列片段。对结果进行分析显示:SRY、SOX和HOX基因同源序列在4种雌雄个体间和种间无性别特异性和种属特异性,并且在SRY和SOX基因同源序列中可能含有内含子。

MicroRNA与动物发育

MicroRNA(miRNA)是一类约22nt大小的内源性非编码RNA,它们通过剪切靶基因的转录产物或者抑制转录产物的翻译从而起到转录后调控靶基因表达的作用。在动物体内,通过基因敲除等方法所进行的大量研究表明了miRNA参与了胚胎早期发育、脑及神经发育、心脏发育、肌肉及骨骼发育等动物发育的各个方面。miRNA是动物发生发育过程中重要的调控因子。主要介绍了近年来miRNA在动物生长发育过程中的研究进展。

开放性实验教学在应用型人才培养中的作用初探

随着当今社会对应用型人才需求的不断增长,传统的实验教学方式已经越来越不能适应现代高等教育的要求,实验教学作为高等学校教育的一个重要环节,开放性实验教学模式应运而生。开放性实验要求学生在牢固掌握教师所授专业理论知识的基础上,到实验中运用和验证,增强学生的感性认识,培养他们的科研动手能力,锻炼其独立操作、独立思考、独立分析问题及解决问题的本领,提高他们的综合素质,因此在教学中的重要地位日渐凸显。文章对开放性实验教学模式的开放性表现以及它在应用型人才培养方面的作用进行了阐述。

牙鲆变态中IGF-I基因表达及甲状腺激素对其的调节作用

胰岛素样生长因子（Insulin-like growth factors,IGFs）是一类具有胰岛素样代谢和促有丝分裂功能的蛋白质,参与脊椎动物的胚胎发育、生长和生殖。IGF系统包括两个配体（IGF-Ⅰ、IGF-Ⅱ）、IGF受体（IGF-I receptor,IGF-I R;IGF-II receptor,IGF-ⅡR）以及IGF结合蛋白（IGF binding proteins，IGFBPs）。

鱼类性别决定及其研究方法进展

近二十年,有关鱼类性别决定的研究取得了很大进展,主要集中在温度、激素以及性别连锁基因、BKM、ZFY、芳香化酶基因、H-Y抗原、Sox、SRY、DMRT1、DMY、DAX-1、核受体基因家族、SF-1和WT-1等性别决定基因对性别分化的调控方面,杂交和分子标记技术则提供了有效的技术手段。这些研究为进一步阐明鱼类决定机制提供了基础和手段,但仍存在一些问题有待探索。阐述了近些年有关鱼类性别决定因子及其研究方法方面的研究动态和进展,并对鱼类性别决定的研究前景、存在的问题和发展的趋势做了简述,以期为系统研究鱼类性别决定机制提供参考。

牙鲆efhd2和tbc1d25基因的克隆和表达分析

为在分子水平解析牙鲆(Paralichthys olivaceus)抗淋巴囊肿病的机理,本研究克隆牙鲆淋巴囊肿抗病免疫相关基因efhd2和tbc1d25的cDNA全序列,运用生物信息学方法对基因序列进行了详细分析;同时,采用荧光定量PCR分析了efhd2和tbc1d25基因在牙鲆胚胎发育不同阶段、淋巴囊肿抗病和患病个体不同组织的表达特征。结果显示,efhd2基因cDNA全长为5231 bp,开放阅读框(ORF)长为699 bp,编码232个氨基酸。tbc1d25基因cDNA全长为3173 bp,ORF长为2601 bp,编码866个氨基酸。定量结果显示,efhd2和tbc1d25基因在胚胎发育的各个时期均有不同程度的表达,其中,efhd2在出膜仔鱼期表达量最高,而tbc1d25在受精卵中的表达量显著高于其他时期(P<0.05)。在所研究的淋巴囊肿抗病和患病个体不同组织中,efhd2和tbc1d25基因均有不同程度的表达,抗病个体的血液中,这2个基因的表达量均显著高于患病个体(P<0.05)。本研究结果为深入探讨efhd2和tbc1d25基因功能和解析牙鲆淋巴囊肿抗病机理提供了基础资料。

三角帆蚌内脏团不同部位插核育珠对珍珠囊形成的影响

对三角帆蚌(Hyriopsis comingii)内脏团不同部位进行插核,研究各组珍珠囊形成、结构以及珍珠质沉积的差异,从而确定出有利于珍珠形成的插核核位。实验选取内脏团5个部位(I:斧足内脏团前端;II:斧足内脏团中部;III:近生殖腺部;IV:近胃部;V:近肾部)进行插核,并分别在插核后第20、50、90、150天(thd)采集内脏团插核部位进行组织固定,利用石蜡切片、HE染色研究不同插核部位珍珠囊结构及珍珠质沉积情况。结果表明:(1)插核施术后20 d,II组插核位点最早形成单层低柱状上皮细胞,为次生珍珠囊;(2)插核施术后50 d,I、II、III组均形成了珍珠囊上皮细胞,而IV、V组插核位点未出现类似的柱状细胞。其中II、III组珍珠囊上皮细胞前端含有大量体积较大的颗粒物;(3)插核施术后90 d,I、III组珍珠囊细胞间出现大量细胞间隙,I、II组珍珠囊表皮细胞具有多核现象的细胞数量增多,且II、III组上皮细胞中颗粒物数量增多,而IV、V组插核位点形成了复层扁平上皮细胞;(4)插核施术后150 d,I、III组珍珠囊内表皮细胞间隙变少。II组珍珠囊上皮细胞游离端存在大量的微绒毛,其与III组相似,珍珠囊上皮细胞细胞核明显增多,颗粒物减少。该时期,IV组在插核位点上形成了不连续的低柱细胞、V组插核位点仍未出现珍珠囊细胞。(5)三角帆蚌在插核术后养殖150 d后,I、II、III组珠核表面出现明显的珍珠质沉积,II、III组珍珠质沉积均匀,I组不均匀,并且II组沉积的珍珠层厚度(0.85 mm±0.06 mm)显著大于I、III组(P<0.05;0.62mm±0.07 mm,0.56 mm±0.03 mm),而IV、V组珠核表面没有珍珠质沉积。研究结果表明,三角帆蚌内脏团不同插核部位珍珠囊上皮细胞的形成存在明显差异,斧足–内脏团前端、斧足–内脏团中部以及近生殖腺部插核能形成完整的珍珠囊结构并沉积珍珠质,其中斧足–内脏团中部插核更有利于珍珠的生长。本研究旨为淡水珍珠贝的内脏团育珠研究工作提供实践基础和理论依据。

染色体研究的新方法与新进展

从染色体显微分离与显微克隆、染色体连锁图谱、染色体原位杂交、染色体涂染、染色体的基因定位以及染色体的片段转移等几个方面,分别综述了染色体研究的新方法和新进展,并展示了分子细胞遗传学的发展前景。

牙鲆let-7基因的克隆与表达及其靶基因预测

let-7是时序发育过程中的重要调控因子,在促进幼体向成体转变过程中起着极其重要的作用。为探讨let-7对牙鲆(Paralichthys olivaceus)从幼体到成体转变的变态发育过程的影响,本实验对let-7进行了克隆与表达研究,并预测了其可能的靶基因。利用普通PCR技术从牙鲆中成功鉴定出let-7及其前体序列,该前体序列在不同的物种间具有高度的保守性。运用实时荧光定量RT-PCR方法分析let-7在牙鲆变态发育不同阶段的表达,结果发现,水温(16±0.5)℃条件下,在牙鲆变态发育的前5个阶段(孵化后17、20、23、29、36 d),let-7的表达量逐渐上升,在变态末期(36 dph)达到高峰,变态结束(41 dph)时表达量呈现下降的趋势。实时荧光定量数据表明,甲状腺激素(T3)上调牙鲆肾细胞中let-7的表达,在浓度为75 nmol/L时,表达量达到最高。靶基因预测发现,let-7作用于多样的靶基因,其靶基因可能参与生长发育、细胞分化、信号转导、病毒免疫等生物过程。本研究建立了let-7在牙鲆变态发育过程中的表达谱,并在细胞水平研究了T3对let-7表达量的影响,预测了其可能的靶基因,为研究let-7在牙鲆变态发育过程中的调控机制奠定了基础。

6种鱼鳃的显微观察

对河鲀、剑尾鱼、斑马鱼、白缘鱼央、拟缘鱼央以及黑尾鱼央的鱼鳃进行了比较观察。斑马鱼和白缘鱼央鳃丝外具有凸起的平行卷曲状上皮,鳃丝表面都具有规则或不规则分布的环形微嵴、沟、坑、孔等结构。鳃小叶排列数量多少的顺序是:拟缘鱼央、黑尾鱼央、剑尾鱼、河鲀、斑马鱼、白缘鱼央;白缘鱼央单个鳃小叶面积最大;河鲀和剑尾鱼鳃弓表面具有纤维状条纹,斑马鱼比较光滑,而白缘鱼央、拟缘鱼央以及黑尾鱼央则具有起伏的沟纹,白缘鱼央尤其明显。比较分析结果显示,鱼央属作为底层肉食性鱼类,其鳃的结构具有诸多特异性,以适应低氧、浑浊、少光、浮游生物丰富的水底栖息环境。其中,白缘鱼央的鳃具有更大的表面积和较高的摄氧效率。

牙鲆NR4A1基因在甲状腺素诱导仔鱼变态中的表达调控分析

NR4A1基因是一个重要的转录因子,在信号转导早期通过对靶基因的特异性转录调控发挥着重要的作用。从牙鲆(Paralichthys olivaceus)中克隆了NR4A1基因c DNA序列,检测了其在牙鲆变态中和成鱼各组织中的表达模式,分析了其在外源甲状腺素(TH)以及硫脲(TU)处理仔鱼中的表达变化。结果表明,牙鲆NR4A1 c DNA全长3264 bp,编码568个氨基酸;牙鲆NR4A1基因与其它物种具有很高的同源性,在系统进化树中与鱼类聚为一支;牙鲆NR4A1基因在成鱼心、肌肉和鰓中高表达;在变态过程中,NR4A1水平逐渐升高,且在25 dph达到最高,之后逐渐降低;TH组中的NR4A1基因水平在变态早期和高峰期显著低于正常组,TU组的水平在变态中后期和结束期显著高于正常组;TU组中变态被抑制的仔鱼在正常海水和0.1 mg·L^(-1)TH海水中饲养6 d后,能够顺利变态,且NR4A1基因在拯救组(TU抑制变态仔鱼在正常海水和0.1 mg·L^(-1)TH海水中饲养)中的表达水平与TU对照组相比显著降低,与正常组中同时期的水平一致。结果表明,牙鲆NR4A1基因可能在仔鱼变态调控中扮演着非常重要的角色。

浅谈如何将生物化学融入公选课微生物与人类生活课程

本文从微生物学发展史、微生物发酵、微生物学前沿研究三个方面探讨如何将生物化学的知识点融入到公选课微生物与人类生活的教学内容中,从而满足学生的求知欲望,提高学生对公选课的兴趣。

铁路集装箱空箱调运问题分析

分析我国铁路集装箱空箱产生原因、空箱调运的特点及成本,提出在集装箱空箱调运过程中实现的目标及遵循的原则。对有时间窗的情况分类处理,求解使机会成本最小及完成重箱运输产生的经济效益最大的空箱调运最优决策。最后,提出了建立集装箱管理信息系统,提高集装箱运用效率,调整集装箱办理站布局,组建联营体、实现集装箱共享等提高集装箱运用效率的建议。

白缘(鱼央)5S rDNA的扩增分析及其在染色体上的FISH定位

本文分别对雌雄白缘(鱼央)(鱼央)的5SrDNA进行了PCR扩增和序列分析,并采用双色荧光原位杂交(FISH)技术,以白缘(鱼央)的5SrDNA序列和小麦的45SrDNA为探针,对其在白缘(鱼央)雌雄中期染色体上进行了FISH定位研究。结果表明,白缘(鱼央)5SrDNA序列无雌雄差异;5SrDNA的保守区序列为117bp;5SrDNA和45SrDNA分别被定位于白缘(鱼央)的性染色体和第5号染色体上。同时从GenBank中获得了22种鱼的5SrDNA,运用DNAman软件构建了23种鱼的系统发育树,对白缘(鱼央)的进化地位进行了初步研究。本研究为阐明白缘(鱼央)在鱼类系统进化中的位置、重复序列在脊椎动物性染色体上的分布状况以及与性别决定与分化的关系,提供了资料积累和分析依据。

外源甲状腺激素对牙鲆IGF-I及其受体基因表达的影响

采用外源的甲状腺激素(thyroid hormone,TH)分别处理变态前牙鲆仔鱼和体外培养的牙鲆胚胎细胞,通过实时定量PCR检测了TH处理前后牙鲆胰岛素样生长因子I(insulin-like growth factor I,IGF-I)及其受体(IGF-I receptors,IGF-IRs)基因的表达变化。在体和离体试验结果显示,过高浓度的TH会降低牙鲆仔鱼和胚胎细胞中IGF-I mRNA的表达,通过添加TH抑制剂硫脲(thiourea,TU)使仔鱼体内IGF-I mRNA上调;两种不同的IGF-IR对TH的响应是不同的,外源的TH能促进IGF-IR-1mRNA的表达,却使IGF-IR-2 mRNA的表达下调。结果表明在牙鲆的生长发育中TH和IGF系统是高度相关的。

牙鲆SRF基因的克隆及真核表达载体的构建

采用RACE-PCR技术,从牙鲆(Paralichthys olivaceus)组织中克隆了血清应答因子(SRF)基因全长序列,该序列全长2 477 bp,开放阅读框1 503 bp,编码500个氨基酸。通过氨基酸同源序列比对,牙鲆SRF与其它物种的同源性较高,在氨基酸序列的N端具有NLS结构域和高度保守的MADS结构域。用PCR方法扩增SRF基因的编码区片段,克隆到p EGFP-N1载体中,构建真核表达载体p EGFP-N1-SRF,将重组质粒转染牙鲆胚胎细胞,在荧光显微镜下观察转染细胞有绿色荧光蛋白表达。荧光定量PCR和Western blot实验进一步证实,SRF在转染细胞中高表达。说明真核表达载体p EGFP-N1-SRF构建成功,为进一步研究SRF在牙鲆变态发育中的作用奠定了实验基础。

牙鲆中Dicer基因的鉴定与表达

通过PCR技术,从牙鲆(Paralichtys olvaceus)总RNA中克隆了牙鲆Dicer基因序列,该序列全长6 585bp,包括5 691 bp的开放阅读框,编码1 896个氨基酸。在多个物种间的蛋白序列对比中,牙鲆Dicer与其它物种的同源性平均高达78%,与尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)同源性最高达到89%;在进化树分析中,牙鲆Dicer与其它鱼类Dicer聚集一支。荧光定量PCR显示,牙鲆Dicer基因在牙鲆大脑里的表达最高。同样的,在牙鲆胚胎和仔鱼早期发育阶段里也发现了相对高水平的Dicer mRNA表达。在用甲状腺激素(TH)处理过程中发现,牙鲆Dicer基因在用TH处理后17 dph的表达最高。本研究预测了牙鲆Dicer在牙鲆发育和变态过程中扮演的重要角色,为进一步阐明Dicer在牙鲆变态发育中的功能奠定了基础。

miR-124和Otx2在牙鲆变态发育期间的表达调控及其靶向关系验证

牙鲆(Paralichthys olivaceus)是研究鱼类变态发育的理想模型,其右眼移位及生活习性的改变受甲状腺激素(TH)调控。同时microRNA (miRNAs)在变态期间发挥关键性作用。为研究TH、pol-miR-124及Otx2在牙鲆变态中的调控机制,本实验通过生物信息学方法预测pol-miR-124潜在靶基因Otx2,首先利用qRT-PCR检测在牙鲆各组织、正常变态及外源TH处理仔鱼后pol-miR-124和Otx2的表达模式。然后克隆400 bp含有“种子序列”的Otx2 3′UTR区序列,构建野生型重组载体pmirGLO-Otx2并转染293T细胞检测双荧光素酶活性确定靶向关系。qRT-PCR结果表明: pol-miR-124和Otx2均在脑和眼睛组织中特异性高表达;在仔鱼变态28 dph表达量最高与变态进程相一致;TH作用下,在20 dph、24 dph时期, pol-miR-124的表达量低于正常组,而Otx2的表达量高于正常组;在28 dph、32 dph、36 dph时期, pol-miR-124的表达量高于正常组,但Otx2的表达量低于正常组,两者呈现出相反的表达趋势;双荧光素酶结果显示pol-miR-124靶向负调控Otx2。本实验旨为揭示牙鲆视觉感光系统的发育机制奠定研究基础,同时为探讨牙鲆变态发育机制提供了新的理论依据。

甲状腺激素受体与Drosha蛋白互作鉴定分析

为了证明甲状腺激素受体(THR)与Drosha蛋白之间的相互作用,以HEK293细胞为材料,利用免疫共沉淀的方法获得蛋白免疫复合物,再经Western blot检测和质谱分析。结果表明,用THR抗体Western blot检测出有THR蛋白的存在,反之Drosha抗体Western blot检测有Drosha蛋白的存在;同时,THR抗体免疫沉淀后的质谱鉴定存在Drosha蛋白,Drosha抗体免疫沉淀后的质谱鉴定也存在THR蛋白,由此说明甲状腺激素受体与Drosha蛋白之间确实存在相互作用。并且,初步筛选出与两者共同作用的54个蛋白,经Go聚类分析揭示鉴定蛋白主要是细胞膜和细胞核中成分,参与细胞迁移、细胞凋亡、蛋白代谢、免疫应答、信号通路调节及转录调控等生物途径,具有核酸结合、细胞骨架结合等分子功能。

牙鲆甲状腺激素受体TRαA介导甲状腺激素调控的靶基因鉴定

为了鉴定牙鲆甲状腺激素受体TRs介导甲状腺激素调控的靶基因,研究采用RT-PCR克隆了TRαA基因的CDS区,并构建了p3×Flag-TRαA重组真核表达载体;该重组质粒转染HEK293T细胞后,RT-PCR、实时定量PCR与Western blot检测均表明牙鲆TRαA在哺乳动物蛋白表达系统中成功转录并翻译;且重组质粒转染的细胞裂解液通过G1亲和层析柱纯化、过滤除菌可得到纯的融合蛋白3×Flag-TRαA,然后双荧光素酶报告实验通过在HEK293T细胞中共转染p3×Flag-TRαA和含候选靶启动子的报告基因表达载体pGL3-Pro-atoh8-1517/1333/708,表明TRαA受体结合在atoh8基因启动子区–1497—–688特异的2个TRE识别序列来调控该基因的转录,即atoh8是TRαA介导甲状腺激素直接调控的靶基因。研究为深入探究甲状腺激素受体TRαA介导甲状腺激素调控的信号通路提供了基础依据。