猫泛白细胞减少症病毒YB-1株的分离鉴定及其与疫苗株的差异性分析

为了解我国吉林省猫泛白细胞减少症病毒(FPV)VP2基因的特征及其与疫苗株的差异,本研究采集吉林省疑似患有猫泛白细胞减少症的猫肛门拭子样品,经PCR检测后将FPV阳性样品接种F81细胞,连续盲传至出现显著细胞病变(CPE),经电镜观察可见直径约20 nm~24 nm的病毒粒子,与FPV形态一致,表明分离出一株FPV,命名为YB-1。经PCR扩增FPV YB-1株VP2全长基因,测序后比对分析并构建进化树,结果显示,该病毒株的VP2蛋白氨基酸序列与GenBank中选取的其他参考株的同源性为96.8%~99.8%;分离株与来自匈牙利的病毒株(933/07,EU360958)处于同一进化分支,与两个疫苗株(EU498681、EU498680)的遗传距离较远。进一步比对该分离株与GenBank中FPV疫苗株的VP2氨基酸序列差异性,发现存在3个氨基酸位点的突变:A^(91)S、I^(232)V、L^(562)V,其中有2个位点A^(91)S、I^(232)V正位于抗原位点结构位置,推测是该病毒株在本地区自然环境、动物宿主内环境中自然选择下逐渐出现的变异,这可能是疫苗造成免疫失败的原因之一。本研究在国内首次对FPV分离株与商品化疫苗株之间的基因差异进行了分析,丰富了国内FPV的资料,为后续FPV疫苗的研发以及风险防控提供了数据支持。

猪附红细胞体eno基因可视化LAMP检测方法的建立与应用

为建立一种快速、便捷、可基层现场检测猪附红细胞体(M.suis)的环介导等温扩增方法(LAMP),本研究参考GenBank已登录的M.suis基因组(NC_015153),以其α-烯醇化酶(eno)基因为目的基因设计合成4条特异引物,经反应条件优化,初步建立了检测M.suis的LAMP方法,其内外引物比为1􀏑6,可在63℃,反应50 min时通过SYBR Green I染料直接经肉眼判定结果。利用该方法检测弓形虫、大肠杆菌、猪链球菌I型、牛源瑟氏泰勒虫和M.suis,结果显示均无交叉反应,特异性强;将新提取的重组质粒pMD-eno 10倍倍比稀释(100~10-7),利用本研究建立的LAMP方法进行敏感性试验,结果显示,该方法对重组质粒pMD-eno最低检测限为30拷贝/μL,比普通PCR检测方法敏感度高100倍,敏感性高;利用建立的LAMP方法对同一时间和不同时间提取的M.suis基因组(101~106)进行组内组间重复试验,结果显示组内与组间检测结果均为阳性,重复性好。利用该方法对84份疑似感染M.suis的猪血液样品进行检测,结果显示LAMP检测结果与PCR方法检测结果一致,表明本研究建立的LAMP检测方法可应用于M.suis临床样品检测。本研究建立的LAMP方法操作简单、特异、灵敏和重复性好,经肉眼可判读结果,适合猪场M.suis感染的现场检测。

延边地区牛病毒性腹泻病毒YBHC株的分离鉴定与遗传进化分析

延边朝鲜族自治州地理位置特殊,边境畜产品贸易往来日见频繁,为了解延边地区牛病毒性腹泻病毒(BVDV)流行株情况,本研究采集延边州规模化养牛场疑似感染BVDV牛的粪便样品,经常规处理后接种MDBK细胞,盲传5代后观察细胞病变并经PCR鉴定,结果显示未出现BVDV典型的空泡病变,PCR扩增得到约300 bp与预期相符的目的条带,结合患牛临床症状初步判定为非细胞病变型(NCP型)BVDV。对5’UTR基因序列(OM622422)的扩增产物测序并进行遗传进化分析,结果显示分离株为BVDV-1b亚型,为NCP型,命名为YBHC株BVDV-1b。对鉴定为BVDV阳性的细胞培养并传至7代,收集细胞经磷钨酸负染后电镜观察,可见典型BVDV病毒粒子,大小为40 nm~60 nm。本研究首次对延边地区进行BVDV流行株的分离与鉴定,并得到病毒粒子,为BVD疫情防控和疫苗研制提供了物质基础和参考依据。