基于理性设计提高1,3-丙二醇氧化还原酶的稳定性和活性

1,3-丙二醇氧化还原酶(1,3-propanediol oxidoreductase,PDOR)是甘油生物合成1,3-丙二醇(1,3-propanediol,1,3-PD)的关键限速酶之一。使用PoPMuSiC 2.1计算肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)来源PDOR(KpPDOR)突变的折叠自由能,结合HotSpot Wizard 3.0对催化中心附近氨基酸的功能热点分析和保守残基鉴定,理性选取突变位点,构建定点突变。经诱导表达、蛋白纯化和酶学性质研究,获得催化性能、热稳定性和pH耐受性提高的突变体。V155N突变体在37℃,pH 7.5下的还原活性为KpPDOR的1.7倍,pH 4.0时是KpPDOR的2.5倍。N262E突变体37℃下半衰期为KpPDOR的1.4倍。分析蛋白结构,发现Val155突变为Asn导致新形成两个氢键,稳定了Val155所在的β-折叠结构。而Asn262突变为Glu形所成的两个氢键,可增强催化中心刚性,提升酶稳定性。静息细胞转化甘油合成1,3-PD,发现突变体V155N工程菌株1,3-PD产能为1.16 mmol/L/OD_(600),高于野生型KpPDOR工程菌株的0.82 mmol/L/OD_(600)。此理性设计方法对改良其他工业酶的性能有一定参考价值。