急性髓系白血病细胞多药耐药相关基因的筛选

目的筛选急性髓系白血病细胞多药耐药相关基因。方法在建立HL-60/DNR多药耐药(MDR)细胞系的基础上,采用抑制消减杂交的方法结合基因芯片技术建立HL-60/DNR抑制消减杂交文库,并挑选其中部分克隆进行序列测定和同源性分析。结果HL-60/DNR对多种化疗药物均产生了不同程度的耐受。在所构建的HL-60/DNR抑制消减杂交文库中,经过基因芯片筛选出明显差异表达克隆共有14个;进一步分析发现这些基因在白血病细胞多药耐药中的作用大多未见报道。结论多种基因(已知的或未知的)均参与了急性髓系白血病细胞多药耐药的调节,大规模筛选与克隆这些基因为进一步研究急性髓系白血病细胞多药耐药产生的机制奠定了必要的理论基础。

人胚胎造血的AGM区基质细胞基因表达谱分析

为了筛选在主动脉-性腺-中肾(AGM)区基质细胞中差异表达的基因,以药物流产的孕30-35天的人胚胎AGM区来源基质细胞为“实验方”,以源自意外而致流产的孕4-5月的水囊引产的胎儿肝组织的基质细胞为“驱动方”,建立了在人AGM区基质细胞中差异表达基因的消减杂交文库。进一步用基因芯片技术对所建立的抑制消减杂交文库进行筛选,并挑选其中明显差异表达的18个克隆进行序列测定和同源性分析。结果表明在所构建的AGM抑制消减杂交文库中,经过PCR鉴定有特异性扩增带且扩增带分子量在200-700bp的克隆有211个,阳性率高达76.4%。经过基因芯片筛选,挑选出ratio值大于5的克隆共18个进行序列测定显示,在测序的18个明显差异表达的阳性克隆中,4个为未知基因,14个为已知基因,其中这些已知基因分别参与了细胞迁移、分化、生长、细胞周期、信号转导及血管发生等细胞重要生命过程。这些基因大多数在胚胎分化造血发育中的作用尚未见报道。结论筛选AGM区基质细胞中差异表达的基因为进一步研究胚胎造血发育的分化调控的分子机理提供了必要的理论基础。

胚胎干细胞及其在移植治疗中的研究进展

胚胎干细胞(embryonic stem cell,ES)因具有多向分化潜能及能在体外不断被扩增的特点,自发现起就受到生命科学领域关注。本文综述了胚胎于细胞的来源,生物学特性,在细胞、组织和器官移植中的应用及人Es应用研究中所面临的问题。

AGM区基质细胞促进小鼠胚胎干细胞向成血-血管干细胞分化的实验研究

目的探讨主动脉-性腺-中肾(AGM)区来源的基质细胞诱导胚胎干细胞(ESC)向成血-血管干细胞分化的促进作用。方法从孕11 d的小鼠胚胎AGM区分离、培养基质细胞,鉴定后用作支持细胞,与小鼠胚胎干细胞共同培养,通过原始细胞集落(BL-CFC)的形成情况及流式细胞仪检测CD34+/Flt-1+细胞比例,评价AGM区基质细胞对小鼠ESC-D3细胞系向成血-血管干细胞的定向诱导作用。结果在AGM区基质细胞的支持下,由ESC来源的CD34+细胞由(12.71±1.76)%增加到(39.71±3.76)%,并且CD34+/Flt-1+细胞比例明显提高,达到(26.59±1.77)%;同时由ESC来源的代表成血-血管干细胞的BL-CFC集落增加了3倍。结论AGM区基质细胞可促进胚胎干细胞向成血-血管干细胞分化,探明其机制对研究造血及血管发育机制有积极意义。

AGM区来源的基质细胞促进造血干细胞扩增的体外实验研究

目的:探讨主动脉-性腺-中肾(aorta-gonad-mesonephros,AGM)来源的基质细胞对造血干细胞(HSC)增殖的促进作用,为探寻HSC的体外扩增方法奠定实验基础。方法:分别从孕11dBALB/c小鼠胚胎AGM区及6周龄小鼠骨髓分离、培养基质细胞,流式细胞仪等对基质细胞进行鉴定;利用小鼠胚胎干细胞(ESC)向造血细胞定向分化的模型,结合高增殖潜能集落(HPP-CFC)、原始细胞集落(BL-CFC)形成实验及流式细胞仪分析CD34+、CD34+Sca-1+细胞比例,对比研究AGM及骨髓基质细胞对ESC来源的HSC的扩增作用。结果:小鼠AGM和骨髓基质细胞在形态及表型上基本相似,均符合基质细胞的特征。AGM和骨髓基质细胞均可促进ESC来源的HPP-CFC的形成,但AGM基质细胞还可促进ESC来源的BL-CFC的形成;流式细胞仪检测发现:在骨髓基质细胞支持下,CD34+细胞增加了3-4倍,但CD34+/Sca-1+却无明显增加;而在AGM基质细胞支持下CD34+、CD34+Sca-1+细胞均明显增加了4-5倍。结论:AGM基质细胞在有效扩增小鼠HSC同时,能很好地维持HSC自我更新及多向分化的潜能。

IL—4基因修饰逆转肝癌细胞多药耐药

目的 探讨IL—4基因修饰对肝细胞癌多药耐药(MDR)的逆转作用及可能机制。方法 用逆录病毒载体将IL—4基因导入人肝癌细胞细胞系HepG2,采用MTT生物活性法检测药物敏感性。间接免疫荧光染色流式细胞仪分析P—糖蛋白(P—gP)。微量荧光分光光度法分析癌细胞内ADM聚集量。结果 IL—4基因修饰显著提高癌细胞对多种化疗药物的敏感性(耐药逆转倍数在6～32倍间)及增加ADM在癌细胞内聚集;P—gP阳性表达率(5％±0.6％)较野生型及空载体修饰细胞(98.5％+0.5％)明显降低。逆转作用可为PKC激活剂TPA所阻断。IL—4基因修饰瘤苗及其培养上清与野生型细胞共培养,也可使野生型瘤细胞产生逆转效应。结论 IL—4基因修饰可通过自分泌、旁分泌形式逆转肝癌细胞MDR,此作用可能与其下调P—gP表达及抑制PKC活性有关。

星形胶质细胞条件培养液促进胚胎干细胞分化为神经元样细胞的实验研究

目的:探讨星形胶质细胞条件培养液在体外能否促进胚胎干细胞(ESCs)向神经元方向分化。方法:在Bain等建立的4-/4+方案基础上,分成两组:单用ATRA组和ATRA联合胎脑星形胶质细胞条件培养液组,分3阶段诱导ESCs定向生成神经元样细胞。形态学观察及畸胎瘤形成试验对ESCs的全能性进行鉴定;免疫组化染色法检测nestin、GFAP、NSE和NF-200的表达对诱导过程进行动态监测。结果:(1)体外培养的小鼠ESC-D3细胞在胚胎成纤维饲养层细胞上连续传代培养,仍保持向3胚层分化的能力。(2)在诱导分化阶段,联合诱导组分化细胞NF-200和NSE的表达阳性率高于单用ATRA组。(3)联合诱导组最终诱导ESCs生成纯度高达73.5%神经元样细胞。结论:采用胚胎脑星形胶质细胞条件培养液可较高产率及纯度地促进ESCs生成神经元样细胞,值得推广应用。

儿童微小病变型肾病综合征致病相关基因筛查

目的比较微小病变型肾病综合征(MCNS)患儿与正常健康儿童外周血单个核细胞(PBMC)的基因表达谱变化,筛查MCNS相关致病基因,为揭示MCNS的发病分子机制和临床治疗提供线索。方法原发性MCNS患儿7例,正常同年龄对照组7例,Trizol法抽提PBMC总RNA;采用人类基因组表达谱芯片检测MCNS及正常健康儿童PBMC基因mRNA水平;采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和荧光定量PCR检测部分基因转录水平,鉴定芯片相关检测结果。结果在33 000个基因转录本中,有969个转录本在MCNS患儿PBMC中存在表达差异,其中表达上调552个,表达下调417个。RT-PCR和荧光定量PCR检测结果与基因芯片较为一致。结论采用人类基因组表达谱芯片可快速有效地检测MCNS患儿PBMC中基因表达谱的变化,进而证实MCNS的发生、发展是涉及多基因改变的复杂过程。

Tcf-1基因在再生障碍性贫血患者骨髓CD4^+T细胞中的表达

目的探讨Tef-1基因在再生障碍性贫血(再障)患者骨髓CD4^+T细胞中的表达情况。方法用Mini-MACS磁珠分选系统分离出骨髓CD4^+T细胞,用半定最RT-PCR方法检测Tef-1 mRNA在再障患者和正常人骨髓CD4^+T细胞中的表达。结果Tef-1 mRNA在再障患者骨髓CD4^+T细胞中的表达水平显著高于正常人(P＜0．01),且重型再障患者骨髓CD4^+T细胞中的表达水平明显高于非重型再障患者(P＜0．01)。结论与正常人相比,Tef-1基因在再障患者骨髓CD4^+T细胞中表达上调,且在重型再障患者骨髓CD4^+T细胞中表达水平更高,推测Tef-1基因表达水平的高低可能与骨髓CD4^+T细胞增殖活化的程度相关。

长链非编码RNA LINC01503在哮喘患儿中的表达及作用的病例对照研究

目的研究长链非编码RNA LINC01503在哮喘患儿中的表达及在巨噬细胞极化中的调控作用,为完善哮喘发病机制及发现新的防治靶点提供实验依据。方法纳入2017年8月26日至2018年1月11日复旦大学附属儿科医院(我院)呼吸科门诊确诊的哮喘患儿(哮喘组)及我院健康体检儿童(健康对照组),分离2组外周血中的单个核细胞,采用RTq PCR检测LINC01503在两组中的表达; LPS与IL-4分别诱导巨噬细胞向M1及M2方向极化,采用RT-qPCR检测LINC01503的动态变化;脂质体转染siRNA敲低LINC01503表达,采用RT-qPCR及Western blot检测LINC01503对巨噬细胞极化的影响。结果哮喘组28例,健康对照组46例。与健康对照组相比,LINC01503在哮喘组中的表达显著升高。LINC01503在M1巨噬细胞中明显下调,而在M2巨噬细胞中明显上调。siRNA敲低实验发现,LINC01503促进M1巨噬细胞的极化,上调M1标志基因如IL-6、TNF-α和CXCL10等的表达; LINC01503抑制M2巨噬细胞的极化,下调M2标志基因如CD206和CD209的表达。Western blot发现LINC01503主要通过促进细胞外调节蛋白激酶(ERK)的磷酸化而影响巨噬细胞极化。结论 LINC01503在哮喘患儿中高表达,通过负反馈调控巨噬细胞的活化,有望成为哮喘治疗的新靶点。

PM2.5促进Th9细胞分化及在哮喘发病中作用的初步研究

目的探讨PM2.5对Th9细胞分化的影响及其在哮喘发病中的作用,为揭示空气污染与哮喘发作的关系及发现新的防治策略提供实验证据。方法采用蟑螂提取物(CRE)作为过敏原建立小鼠哮喘模型,在激发阶段向小鼠气道内滴加不同浓度的PM2.5悬液,通过肺泡灌洗液(BAL)细胞计数、肺部切片HE染色和气道阻力检测来判定PM2.5是否能加重哮喘的发生。流式细胞术检测肺门淋巴结中Th9细胞比例;荧光定量PCR(q PCR)检测肺组织匀浆中IL-9基因的表达。在体外分离CD4+幼稚T细胞,用TGF-β和IL-4诱导CD4+幼稚T细胞分化为Th9细胞,用流式细胞术、q PCR检测PM2.5对Th9细胞分化及对相关转录因子PU.1、B细胞活化转录因子(BATF)的影响。结果与单纯CRE激发的小鼠哮喘模型相比,PM2.5与CRE联合处理组(PM2.5+CRE)能显著增强哮喘炎症反应,PM2.5+CRE组小鼠的肺泡灌洗液中总细胞计数、嗜酸性粒细胞、中性粒细胞、巨噬细胞和淋巴细胞的数量较CRE组均明显上升,肺部被炎症细胞浸润的程度及气道阻力较CRE组明显增加。PM2.5+CRE能显著上调肺组织中IL-9表达以及肺门淋巴结中Th9阳性细胞比例。体外分化细胞中,PM2.5+CRE组IL-9阳性细胞的比例(52.0±5.8)%较CRE组(31.7±3.2)%明显增高(P=0.000 4)。PM2.5能显著上调IL-9及PU.1、BATF等Th9细胞调控基因的表达。结论大气细颗粒物PM2.5可加重过敏原诱发的哮喘炎症,在体内外可显著增强Th9细胞的分化,提示PM2.5可能通过增强Th9细胞的分化加重哮喘。

环状RNA circHIPK3在儿童哮喘中的表达和作用研究

背景环状RNA在多种疾病中发挥重要作用,但目前尚无环状RNA在儿童哮喘中的研究报道。有报道环状RNA circHIPK3在过敏性鼻炎中调控Th2细胞的分化。目的探讨环状RNA circHIPK3在儿童哮喘发病中可能的作用机制。设计收集临床样本,检测circHIPK3的表达并检测其与T细胞转录因子的相关性。构建小鼠哮喘模型进一步验证。进行相关的生物信息学分析,并分析circHIPK3与儿童哮喘相关临床指标的相关性。方法纳入2017年8月26日至2019年8月5日复旦大学附属儿科医院呼吸科门诊确诊的哮喘患儿(哮喘组),以同期体检的健康儿童作为对照组。分离两组外周血单个核细胞(PBMCs),通过qRT⁃PCR检测circHIPK3和T盒子转录因子(T⁃bet)在两组的表达情况,并进行相关性分析。建立蟑螂提取物(CRE)诱导的小鼠哮喘模型,用qRT⁃PCR检测小鼠肺组织中的circHIPK3、T⁃bet的表达情况。通过生物信息学分析circHIPK3与T⁃bet之间的调控关系。分析circHIPK3与外周血嗜酸性粒细胞的相关性。主要结局指标circHIPK3和T⁃bet的相对表达量以及二者的相关系数。结果哮喘组43例,均为轻度哮喘,男35例,中位年龄6.5岁。对照组28例,男22例,中位年龄6.4岁。与对照组相比,circHIPK3(t=4.627,P<0.001)和T⁃bet(t=2.727,P<0.01)在哮喘组PBMCs中均呈低表达;在哮喘患儿中circHIPK3与T⁃bet呈正相关(R=0.4830,P=0.0007)。哮喘小鼠肺组织中的检测结果与之一致。检索GEO数据库发现,哮喘患儿miR⁃485⁃3p增高。生物信息学分析发现:circHIPK3与miR⁃485⁃3p存在竞争结合关系,T⁃bet是miR⁃485⁃3p的可能靶基因。哮喘患儿中,circHIPK3与外周血中嗜酸性粒细胞数量呈负相关(R=-0.3692,P=0.0191)。结论circHIPK3在儿童哮喘和哮喘模型小鼠中表达下调,可能通过吸附miR⁃485⁃3p的方式影响T⁃bet的表达,引起Th1/Th2失衡,影响哮喘的炎症表现。

核转录因子在细胞因子介导的川崎病血管内皮损伤中的作用机理

目的 探讨核转录因子 (NF κB)在诱导川崎病炎性细胞因子及血管内皮细胞损伤中的作用及机理。方法 建立人脐静脉内皮细胞培养模型 ,酶联免疫吸附实验 (ELISA)双抗体夹心法检测川崎病患儿外周血单个核细胞 (PBMC)活化后培养上清液白细胞介素 6 (IL 6 )、白细胞介素 1β(IL 1β)、肿瘤坏死因子α(TNF α)的分泌量 ;采用AnnexinⅤ /PI双染色法 ,流式细胞仪检测川崎病患儿PBMC培养上清液所诱导的内皮细胞凋亡率 ;凝胶电泳迁移率转换实验 (EMSA)检测所活化PBMC核因子NF κB的活性。结果 川崎病组患儿PBMC体外经刺激后IL 6、IL 1β、TNF α等炎性细胞因子的分泌均明显高于正常对照组 (P <0 0 1) ,其培养上清液所诱导的内皮细胞凋亡率 [(38 4± 7 8) %]则较正常对照组 [(2 8± 0 8) %]明显升高。分别加入足量白细胞介素 6单克隆抗体 (IL 6McAb)、肿瘤坏死因子α单克隆抗体 (TNF αMcAb)、白细胞介素 1β受体a(IL 1ra)或联合加入上述阻断剂于川崎病患儿PBMC培养上清液中 ,可不同程度地逆转川崎病患儿PBMC培养上清液所诱导内皮细胞的凋亡。川崎病患儿PBMC刺激活化后NF κB活性显著增高。NF κB抑制剂SN50 明显抑制川崎病患儿PBMC上述细胞因子的分泌 。

多药耐药相关基因HV126的电子克隆及在化疗前后白血病细胞中的表达

目的 探讨白血病细胞多药耐药发生的分子机理,寻找新的多药耐药相关基因。方法 以HL- 6 0细胞为“驱动方”,以多药耐药细胞系HL- 6 0 / VCR为“实验方”,建立人白血病多药耐药细胞系HL-6 0 / VCR抑制消减杂交文库,利用基因芯片技术从中筛选出一条在野生型HL - 6 0细胞中基本不表达,而在HL - 6 0 / VCR耐药细胞中呈低丰度差异表达的新表达序列标记序列。用表达序列标记拼接的同源基因克隆法得到人类新基因HV12 6序列,再利用生物信息学数据库和软件对其进行功能的预测和分析。最后针对推导序列开放阅读框设计引物,逆转录-聚合酶链反应检测推导HV12 6基因序列在临床白血病患者化疗前后白血病细胞中的表达。结果 HV12 6的c DNA序列长1991bp,编码36 5个氨基酸,其编码蛋白序列局部与新近发现的在细胞凋亡与炎症反应中起重要作用的蛋白基序“PYRIN”存在约4 3%的相似性。逆转录-聚合酶链反应结果提示该基因与白血病细胞受化疗药物的作用和耐药存在联系。结论 HV12 6可能是与白血病细胞耐药相关的一条新基因,有必要对该基因进行进一步的实验室克隆与功能研究。

白细胞介素-10在川崎病炎性细胞因子介导的血管损伤中的作用初探

目的 探讨白细胞介素 10 (IL 10 )在炎性细胞因子介导的川崎病血管内皮损伤中的作用及机制。方法 建立人脐静脉内皮细胞培养模型 ,ELISA双抗体夹心法检测川崎病患儿外周血单个核细胞 (PBMC)活化后培养上清IL 6、IL 1β、肿瘤坏死因子 α(TNF α)、IL 10的分泌量 ;AnnexinV/PI双染色法 ,流式细胞仪检测川崎病患儿PBMC培养上清所诱导的内皮细胞凋亡率 ;凝胶电泳迁移率转换实验 (EMSA)检测所活化PBMC核因子NF κB活性。结果 川崎病组患者PBMC体外刺激活化后IL 6、IL 1β、TNF α等炎性细胞因子及IL 10的分泌量均明显高于正常对照组 (P <0 0 1) ,其培养上清所诱导内皮细胞凋亡率 (38 4± 7 8) %较正常组 (2 8± 0 8) %明显升高。抗IL 6、TNF αMcAb、IL 1ra加入川崎病患儿PBMC培养上清 ,可不同程度抑制川崎病患儿PBMC培养上清所诱导内皮细胞的凋亡 ,而抗IL 10McAb加入川崎病患儿PBMC培养上清所诱导内皮细胞的凋亡细胞反而增多 ,凋亡细胞的百分率高达 (5 8 6± 14 6 ) %。川崎病患儿PBMC刺激活化后核因子NF κB活性显著增高。于PBMC培养上清加入IL 10 ,可见伴随着IL 6、IL 1β、TNF α等炎性细胞因子在PBMC中的表达降低 ,NF κB活性也降低 ,同时内皮细胞凋亡明显减少。结论 IL 10抑制川崎病患儿免疫?

Mcl-1基因在HL-60细胞对全反式维甲酸耐药机制中的作用

目的探讨髓系白血病-1(Mcl-1)基因在HL60细胞对全反式维甲酸(ATRA)耐药中的作用。方法采用少量、递增、反复ATRA诱导HL-60细胞,建立ATRA耐药细胞系HL60/ATRA;利用鸡尾酒法制备Mcl-1基因的小片段干扰RNA(SmallinterferenceRNA,siRNA),并通过脂质体介导将其导入HL60/ATRA细胞;Westernblot检测Mcl-1蛋白在细胞中的表达;MTT实验、NBT还原反应实验、TUNEL免疫组化染色法分别检测细胞的增殖、分化和凋亡情况。结果HL60/ATRA细胞Mcl1蛋白相对灰度值为0.624±0.127,较野生型HL60细胞(相对灰度值为0.162±0.127)明显高表达,并可耐受100nmol/L的ATRA,而不发生分化、凋亡[凋亡率为(1.0±0.5)%];Mcl1siRNA导入HL60/ATRA细胞后,Mcl1蛋白表达下调(相对灰度值为0.267±0.086),恢复对ATRA的敏感性[凋亡率为(18.5±4.5)%]。结论Mcl1基因可能参与了HL60细胞ATRA耐药的形成;抑制Mcl-1基因可能成为一种新的逆转ATRA耐药的策略。

Sonic hedgehog信号通路对AGM区来源的成血-血管细胞增殖、迁移和分化作用

目的探讨 Sonic hedgehog(shh)信号通路对小鼠主动脉-中肾-肾上腺(AGM)区来源的成血-血管细胞增殖、分化和迁移的影响。方法联合应用抗小鼠 CD34、Flk1单克隆抗体(单抗)的磁珠,从孕11 d BALB/c 鼠胚胎 AGM 区分离培养成血-血管干细胞,并同时培养 AGM 区来源基质细胞,用流式细胞术对所分离细胞进行表型鉴定。用免疫组织化学法检测基质细胞表达 Shh 蛋白的情况;借助 Transwell 细胞共培养体系,观察在 AGM 的基质细胞共培养体系中,不同浓度的 Shh 活性肽及其单抗对成血-血管干细胞增殖、细胞周期、迁移及向内皮细胞定向分化的影响。结果 AGM 区基质细胞高表达 Shh 蛋白(阳性率高达90%以上),并可促进成血-血管干细胞增殖,其增殖效应可被10.00 μg/mlShh 单抗阻断;0.10～10.00 μg/ml 外源性 Shh 活性蛋白与 AGM 区基质细胞共培养的成血-血管干细胞,可使成血-血管干细胞长时间增殖,并促进细胞迁移,但并不诱导细胞凋亡与分化;而当0.10～10.00 μg/ml 外源性 Shh 活性蛋白作用于单独培养的成血-血管干细胞,细胞经过短时间增殖后,随后发生凋亡并向内皮细胞分化。结论 Shh 信号通路参与了成血-血管干细胞的增殖、分化、凋亡及迁移等生物学特性的调控,但其具体作用存在时空的差异,AGM 区微环境对 Shh 信号通路具有整合和调试的作用。