奶牛炎性子宫局部T淋巴细胞亚群分析与活化

【目的】探究子宫内膜炎引发奶牛屡配不孕的内在机制。【方法】采用分泌物观察和迪夫染色液检查嗜中性粒细胞浸润方法,采用牛脏器组织淋巴细胞提取试剂盒提取牛子宫淋巴细胞,流式细胞仪鉴定淋巴细胞亚群并筛选调节性T细胞,qRT-PCR方法检测LPS刺激子宫内膜上皮细胞来源外泌体对调节性T细胞CTLA4、PD-1和Galectin-1活化因子表达影响。【结果】细胞学鉴定发现患病子宫腔液内有大量嗜中性粒细胞浸润。健康奶牛子宫腔液中仅有明显完整的脱落的上皮细胞,未见嗜中性粒细胞浸润;流式细胞术鉴定患子宫内膜炎子宫局部T淋巴细胞数量增加的同时亚群组成也发生变化,尤其Tc细胞组成比例显著升高;分选得到的调节性T细胞与LPS刺激子宫内膜上皮细胞来源外泌体共孵育极显著的降低了调节性T细胞活化基因CTLA4、PD-1和Galectin-1基因的表达。【结论】奶牛子宫内膜炎症条件下,子宫内膜上皮细胞来源外泌体是奶牛子宫局部T淋巴细胞亚群组成变化与调节性T细胞活化的一个重要诱发因子,通过抑制Treg细胞的活化,增强Tc细胞的杀伤作用导致奶牛最终繁殖效率的降低。

E_(2)通过p38 MAPK及PI3K/Akt信号通路调控奶牛子宫内膜上皮细胞中COX-2的表达

为了探究p38 MAPK及PI3K/Akt信号通路是否参与雌二醇(E_(2))对奶牛子宫内膜上皮细胞中COX-2的表达及PGF_(2α)分泌的调节,通过体外培养妊娠早期奶牛子宫内膜上皮细胞,并添加E_(2)单独或联合p38 MAPK抑制剂SB203580和PI3K抑制剂LY294002处理奶牛子宫内膜上皮细胞。通过Western Blot、qRT-PCR检测COX-2基因和蛋白的表达,ELISA技术检测PGF_(2α)的水平变化。结果显示:E_(2)促进了妊娠早期奶牛子宫内膜上皮细胞中COX-2的表达和PGF_(2α)的分泌;与此同时,E_(2)激活了p38 MAPK及PI3K/Akt信号通路,添加SB203580和LY294002则抑制了E_(2)对COX-2表达及PGF_(2α)分泌的促进作用。说明E_(2)通过激活p38 MAPK及PI3K/Akt信号通路促进了COX-2的表达及PGF_(2α)的分泌。

活体采卵技术在荷斯坦奶牛繁殖中的应用

[目的]为提高优质奶牛的繁殖力,保证低成本的情况下大量生产优质胚胎,对荷斯坦奶牛采用活体采卵的方式采集卵母细胞。[方法]将4头荷斯坦奶牛分为超排组和非超排组2组,超排组对试验牛注射FSH,非超排组对对照牛不采取任何处理。对荷斯坦奶牛进行活体采卵,并对卵母细胞数进行统计。[结果]共采集到12枚卵母细胞,经过受精培养后有8枚受精卵发育良好。[结论]采用优化的活体采卵程序并配合超排技术,能够更好地利用良种奶牛,以达到动物胚胎生产和辅助生殖的目的。

外泌体miR-218抑制脂多糖诱发子宫内膜上皮细胞免疫因子释放研究

【目的】探究奶牛子宫内膜上皮细胞来源外泌体及其miR-218在减轻大肠杆菌脂多糖诱发免疫反应中的作用。【方法】用不同质量浓度大肠杆菌脂多糖作用于奶牛子宫内膜上皮细胞系24 h后采用细胞计数试剂盒检测细胞活性;酶联免疫吸附测定检测免疫因子IL-1β和TNF-α释放;采用透射电子显微镜和蛋白印记法验证提取外泌体的粒径和标识蛋白CD63表达,荧光定量聚合酶链式反应法检测外泌体中miR-218表达变化;采用激光共聚焦显微镜观察外泌体与奶牛子宫内膜上皮细胞融合;细胞转染mimics 218检测其对大肠杆菌脂多糖诱发奶牛子宫内膜上皮细胞免疫因子释放的影响。【结果】100μg/mL大肠杆菌脂多糖处理奶牛子宫内膜上皮细胞后,IL-1β、TNF-α含量均显著高于对照组(P<0.05);大肠杆菌脂多糖刺激奶牛子宫内膜上皮细胞来源外泌体中miR-218的表达量极显著低于奶牛子宫内膜上皮细胞来源外泌体中miR-218的表达量(P<0.01);正常培养奶牛子宫内膜上皮细胞来源外泌体能够与大肠杆菌脂多糖处理的奶牛子宫内膜上皮细胞融合并与NF-ΚB(p65)蛋白共定位于细胞质中。将奶牛子宫内膜上皮细胞来源外泌体加入到100μg/mL大肠杆菌脂多糖处理奶牛子宫内膜上皮细胞24 h后,显著抑制了大肠杆菌脂多糖引起的奶牛子宫内膜上皮细胞培养上清中的IL-1β和TNF-α释放(P<0.05)。同样的,转染进奶牛子宫内膜上皮细胞内mimics 218与磷酸化的NF-ΚB(p65)核外部分共定位并显著抑制了大肠杆菌脂多糖诱发的奶牛子宫内膜上皮细胞中TNF-α释放(P<0.05),而对IL-1β释放无显著差异。【结论】miR-218能够随着健康子宫内膜上皮细胞分泌外泌体进入到受到大肠杆菌脂多糖刺激奶牛子宫内膜上皮细胞内,并与磷酸化p65核外部分共定位并抑制大肠杆菌脂多糖引起的TNFα的释放。

整合素αvβ3在人工受精奶牛受孕前后表达规律研究

本试验通过对10头荷斯坦奶牛在受孕前后的整合素αvβ3表达变化规律与奶牛早期妊娠关系的研究,筛选早期妊娠检测标志性因子,从而提高奶牛的繁殖效率。试验表明,选取的10头荷斯坦奶牛中有7头受孕3头未受孕,检测发现,10、13、16、19d,αv基因和β3基因转录及整合素αvβ3表达水平在受孕奶牛血液中的表达量均高于未孕奶牛,特别是输精后第16d受孕奶牛的表达量显著高于未孕奶牛。因此,αvβ3检测可将早孕检测的时间窗口提前到人工输精后第16d。

Wnt7a和孕酮受体在人工受精奶牛受孕前后表达规律研究

旨在筛选奶牛早期妊娠诊断标志因子,提高奶牛养殖经济效益。在北京某牛场选10头荷斯坦奶牛,在输精后第1、4、7、10、13、16、19天取血,通过荧光定量PCR和western blotting方法分析Wnt7a和PR的表达趋势和变化规律。通过直检对10头荷斯坦奶牛进行怀孕检测,其中有7头受孕3头未受孕。通过检测受孕和未孕的奶牛血液中Wnt7a基因和PR基因的表达量,发现Wnt7a基因在受孕奶牛血液中的表达量均高于未孕奶牛,特别是输精后第7天受孕奶牛的表达量显著增高,Wnt7a的蛋白质水平表达呈现出类似趋势;PR基因在全部10头奶牛中呈现出从输精后第一天表达开始降低,并一直维持一个很低的表达状态。Wnt7a具有作为奶牛早期妊娠诊断标志因子的潜质,其优势在于将检测窗口提前到输精后的第7天;PR不具有作为标志因子的优势。通过探究影响早期妊娠的相关因子变化规律,可以为孕检的时间窗口提前到早期妊娠阶段提供理论依据。

CoCl_(2)诱导低氧对奶牛胎盘滋养层细胞活性的作用

【目的】为研究奶牛胎盘发育提供基础依据。【方法】使用CoCl_(2)构建奶牛胎盘滋养层细胞低氧模型,并筛选出试验所需最适CoCl_(2)浓度;实时荧光定量PCR方法检测低氧对胎盘滋养层细胞胎盘生长因子(Placental growth factor,PLGF)mRNA表达的影响;显微镜观察低氧对Transwell小室中细胞迁移和浸润能力的影响;采用蛋白质印迹法(Western Blot)检测细胞中E-钙黏蛋白(E-Cadherin)的表达。【结果】通过检测细胞中低氧诱导因子-1α表达量确定试验所需的最适CoCl_(2)浓度为200μg/mL;Transwell小室法检测发现,低氧环境下细胞增殖缓慢,伪足数量和合胞体数量减少,迁移减缓,迁移率下降;实时荧光定量PCR结果显示,PLGF mRNA的表达并不受氧分压变化的影响;Western Blot结果显示E-Cadherin的表达量在低氧环境下表现出显著下降趋势。【结论】低氧能够抑制奶牛胎盘滋养层细胞的增殖、迁移与E-Cadherin的表达,但对PLGF mRNA的表达无显著作用。