苯并[a]芘恶性转化16HBE细胞元素组分析及铜与顺铂或长春瑞滨联用对细胞增殖的作用

目的研究苯并[a]芘(BaP)致细胞恶性转化中元素组的变化,探讨铜与顺铂或长春瑞滨联用对细胞增殖的影响。方法以16HBE细胞和BaP恶性转化细胞T-16HBE-C1细胞为研究对象,采用电感耦合等离子质谱分析44种元素在2种细胞中的含量,采用偏最小二乘回归分析元素含量对2种细胞的区分能力,采用MTT法检测铜(0,237,340,487,1000和1432μmol·L^(-1))、顺铂(0,4.4,6.1,8.6,12.0和16.8μmol·L^(-1))和长春瑞滨(0,3.8,9.8,25.0,40.0和64.0μmol·L^(-1))对2种细胞存活率的影响,计算半数抑制浓度(IC_(50))。根据IC_(50)比例制备铜与顺铂混合物和铜与长春瑞滨混合物,采用MTT法检测其对细胞存活率的影响,并采用等效线图法分析铜与顺铂或长春瑞滨的联合作用。采用MTT法检测铜(0,50,100,200,400和800μmol·L^(-1))与IC_(50)的顺铂或长春瑞滨联用对T-16HBE-C1细胞存活率的影响。结果在2种细胞中共检出29种元素,其中铜、锌、银、硒和铷含量在T-16HBE-C1细胞中较16HBE细胞降低(P<0.01,P<0.05),钼、砷、锂、锗、锶、镍、镧、汞、铁和铯含量升高(P<0.01,P<0.05)。元素含量可用于区分16HBE和T-16HBE-C1细胞。铜可抑制16HBE和T-16HBE-C1细胞增殖,IC_(50)分别为(613±16)μmol·L^(-1)和(776±15)μmol·L^(-1)(P<0.01)。铜与顺铂混合物(1∶69.5)和铜与长春瑞滨混合物(1∶33.4)抑制T-16HBE-C1细胞增殖,且铜与顺铂和长春瑞滨具有相加作用。与单独IC_(50)浓度的顺铂(11.2μmol·L^(-1))或长春瑞滨(23.2μmol·L^(-1))相比,当铜>400μmol·L^(-1),其与IC_(50)浓度的顺铂或长春瑞滨联合作用可抑制T-16HBE-C1细胞增殖。结论16HBE细胞经BaP恶性转化后元素含量和相关关系发生改变。铜可抑制T-16HBE-C1细胞增殖,且在高浓度时与顺铂和长春瑞滨具有相加的联合作用。

苯并[a]芘恶性转化细胞THBEc1致裸小鼠原位肺癌模型的构建及血清人源神经纤维网蛋白2对该模型的诊断价值

目的建立苯并[a]芘(BaP)恶性转化人支气管上皮细胞T-16HBE-C1(THBEc1)的裸小鼠原位肺癌模型,评估血清人源神经纤维网蛋白2(NRP2)对该模型的诊断价值。方法12只雄性ICR小鼠随机分为3组,右肺分别一次性注射无菌生理盐水20,30和40μL,观察14 d内小鼠死亡数,以确定小鼠肺内注射安全体积。16只雄性BALB/c-nu裸小鼠随机分为4组:对照组[皮下和肺内同时一次性接种人支气管上皮16HBE(HBE)细胞,皮下1×10^(6),肺内2×10^(5)]、皮下荷瘤模型组(皮下一次性接种THBEc1细胞1×10^(6))、原位肺癌模型组(肺内一次性接种THBEc1细胞2×10^(5)或5×10^(5))。接种后每7 d监测小鼠体重和皮下肿瘤体积;HE染色检测肺肿瘤和皮下肿瘤组织病理特征,计算成瘤率;酶联免疫吸附实验(ELISA)检测裸小鼠血清和胸水中人源NRP2水平;采用受试者工作特征(ROC)曲线确定血清人源NRP2对THBEc1细胞导致的裸小鼠原位肺癌模型的诊断价值。结果肺内注射40μL无菌生理盐水可致2/4小鼠死亡,20和30μL组未见小鼠死亡,但整体表现欠佳,故后续实验注射体积选择20μL。对照组裸小鼠均未在接种部位检出肿瘤,小鼠体重持续增长;皮下荷瘤模型组祼小鼠全部成瘤,体重显著低于对照组(P<0.05)。接种细胞后第10天,原位肺癌模型5×10^(5)细胞组裸小鼠全部成瘤(4/4);第14天,原位肺癌模型2×10^(5)细胞组裸小鼠3/4成瘤,且2个剂量组小鼠体重均低于对照组(P<0.01,P<0.05),肿瘤组织均呈鳞状细胞癌特征。ELISA结果显示,对照组裸小鼠血清人源NRP2水平均显著低于皮下荷瘤模型(4只)和原位肺癌模型(7只)裸小鼠(P<0.05)。原位肺癌模型组(4只)裸小鼠胸水中均可检出高水平的人源NRP2。ROC曲线显示,血清人源NRP2水平能有效区分THBEc1细胞在裸小鼠肺内是否成瘤,最佳截断值为123.00 ng·L^(-1)。结论通过肺内注射接种THBEc1细胞建立了裸小鼠原位肺癌模型,血清人源NRP2可用于该模型诊断。

北京市大气细颗粒物的遗传和非遗传毒性研究

用胞质阻断微核试验与单细胞凝胶电泳法检测北京市大气PM2.5无机提取物与有机提取物对Balb/c 3T3细胞微核形成与DNA链断裂的影响;通过划痕染料示踪技术(SL/DT)观察PM2.5无机提取物与有机提取物对Balb/c3T3细胞间通讯的影响.发现PM2.5有机提取物可引起双核微核细胞率显著增加(P<0.01)及导致慧星细胞率和DNA迁移长度显著增加(P<0.01);PM2.5有机提取物引起细胞间通讯的抑制; PM2.5无机提取物未见明显毒作用.结果表明,PM2.5可引起染色体损伤和原发性DNA损伤,抑制细胞间通讯,其毒作用主要由其有机成分引起.

北京市大气细颗粒物对Balb/c3T3细胞周期的影响

研究了北京市大气细颗粒物有机提取物 (EOC)对Balb c 3T3细胞周期及调节因子的影响 .实验发现 116 μg mL细颗粒物EOC即有明显的细胞毒性 ,抑制细胞生长 ,并存在剂量 反应关系 ,IC50 为 4 0 2 2 μg mL ;流式细胞仪分析显示 136 6 μg mLPM2 5EOC可造成细胞周期改变 ,G0 G1期、G2 M期细胞分布增加 ,分别为 16 2 4 % (P <0 0 1)与 3 17% (P <0 0 5 ) ,S期细胞分布减少 2 0 4 % (P <0 0 1) ,并伴有P5 3含量的增加 ;4 0 9 8、4 78 1μg mL的PM2 5EOC可诱导Balb c3T3细胞凋亡 .提示PM2 5有机提取物可能通过P5 3途径引起Balb c 3T3细胞周期阻滞 ,并诱导细胞凋亡 .

StAR蛋白表达及线粒体超微结构改变在锰抑制雄性大鼠睾酮合成中的作用

目的 研究锰对雄性大鼠睾酮合成的影响及其可能机制。方法 雄性成年SD大鼠用MnCl27.5 ,15和 30mg·kg- 1·d- 1ip 4 0d ,用放射免疫测定法测定血清睾酮含量 ,电镜观察大鼠睾丸间质Ley dig细胞超微结构改变及应用Western印迹法测定甾类激素合成急性调节蛋白 (StAR)在分离的大鼠睾丸间质Leydig细胞线粒体中的水平 ,并测定了睾丸和附睾的脏器系数。结果 与正常对照组相比 ,MnCl2染毒组雄性SD大鼠血清睾酮含量、StAR蛋白表达均明显下降 ,大鼠睾丸间质Leydig细胞胞内线粒体变形、肿胀、空泡化。 30mg·kg- 1组大鼠睾丸脏器系数也明显下降。结论 MnCl2 可以降低雄性大鼠的睾酮合成 ,其机制与睾丸间质Leydig细胞StAR蛋白表达的下降有关 ,锰所致线粒体功能的损害也可能是StAR蛋白表达下降的原因之一。

叉头框蛋白A1基因敲除对苯并[a]芘恶性转化细胞THBEc1转录组的影响

目的 研究叉头框蛋白A1(FOXA1)基因敲除对苯并[a]芘(BaP)恶性转化细胞THBEc1转录组的影响,探讨FOXA1在BaP致癌作用中的可能机制。方法 以FOXA1敲除细胞THBEc1-ΔFOXA1-c34和对照细胞THBEc1-ctrl为研究模型,采用Western印迹法测定FOXA1蛋白表达水平,分别采用克隆形成实验和Transwell实验测定细胞增殖和迁移能力。采用二代测序技术检测THBEc1-ΔFOXA1-c34与THBEc1-ctrl细胞间差异表达基因,并通过实时荧光定量PCR(RT-qPCR)对转录组测序结果进行验证。采用DAVID数据库对差异表达基因进行基因本体论(GO)和京都基因与基因百科全书(KEGG)通路富集分析。采用STRING 11.5数据库和Cytoscape 3.8.2对差异基因编码蛋白进行网络分析。结果 THBEc1-ΔFOXA1-c34细胞未检出FOXA1表达,且增殖和迁移能力均低于THBEc1-ctrl(P<0.01)。转录组差异分析共检出1332个基因在THBEc1-ΔFOXA1-c34与THBEc1-ctrl细胞间的表达差异倍数>2或<0.5(错误发现率<0.05),其中691个基因在THBEc1-ΔFOXA1-c34中表达高于THBEc1-ctrl,641个基因在THBEc1-ΔFOXA1-c34中表达低于THBEc1-ctrl。RT-qPCR验证的47个基因的表达差异和统计学P值与转录组测序结果一致。差异表达基因涉及多种生物学过程,主要包括血管生成、细胞增殖、迁移、黏附、炎症反应、免疫应答、信号转导[包括肿瘤坏死因子(TNF)、丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)、磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B和转化生长因子β(TGF-β)等通路]和代谢等。在349个差异表达基因所编码的蛋白质形成的相互作用网络中,共发现分别以C-C趋化因子配体3(CCL3)、O-聚糖合酶葡糖胺基(N-乙酰基)转移酶3(GCNT3)、基质金属蛋白酶3(MMP3)和卷曲蛋白8(FZD8)为种子节点的4个核心功能模块。核心功能模块主要参与免疫应答和炎症反应、O-聚糖加工、胶原分解代谢过程以及典型WNT通路等。结论 敲除FOXA1后BaP恶性转化细胞THBEc1转录组明显改变,增殖和迁移能力明显降低。FOXA1敲除可能通过直接或间接影响TNF,MAPK和WNT等通路抑制细胞增殖和迁移。FOXA1可能作为BaP致癌的潜在生物标志物和肺癌的潜在治疗靶点。

镧离子和酸根离子在镧盐诱导HepG2细胞特定基因表达改变中的作用

目的探究镧离子(La^(3+))与酸根离子(SO_(4)^(2-),Cl^(-)和NO_(3)^(-))在镧盐诱导Hep G2细胞特定基因表达改变中的作用。方法分别将含有La_(2)(SO_(4))_(3)0.71 mmol·L^(-1)、La Cl_(3)1.41 mmol·L^(-1)、La(NO_(3))_(3)1.41 mmol·L^(-1)、H_(2)SO_(4)2.12 mmol·L^(-1)、HCl 4.23 mmol·L^(-1)和HNO_(3)4.23 mmol·L^(-1)的培养液在CO_(2)培养箱中进行酸碱平衡1 h,p H值可恢复到7.25,随后分别处理对数生长期Hep G2细胞48 h。采用CCK-8试剂盒检测受试物对细胞存活率的影响。采用实时荧光定量PCR(RT-q PCR)检测丙氨酰氨基肽酶(ANPEP)、细胞色素P450家族1A1(CYP1A1)、氧化固醇结合蛋白样7(OSBPL7)、CYP3A5、钙电压门控通道辅助亚单位γ4(CACNG4)、双特异性磷酸酶4(DUSP4)、Ras蛋白特异性鸟嘌呤核苷酸释放因子1(RASGRF1)和CYP17A1 m RNA表达水平。结果CCK-8法检测结果显示,与细胞对照组比较,3种镧盐和HCl处理组细胞存活率均降低(P<0.01),而H_(2)SO_(4)和HNO_(3)处理组细胞存活率均未见明显改变。RT-q PCR结果显示,与细胞对照组比较,La_(2)(SO_(4))_(3),LaCl_(3)和La(NO_(3))_(3)均可诱导Hep G2细胞ANPEP,CYP1A1,OSBPL7,CYP3A5,CACNG4,DUSP4,RASGRF1和CYP17A1等8个基因m RNA表达上调(P<0.05);SO_(4)^(2-)诱导ANPEP和CYP1A1表达(P<0.05);Cl^(-)诱导CYP1A1表达(P<0.05);NO_(3)^(-)诱导ANPEP和CYP3A5 m RNA表达,而抑制CYP1A1和CACNG4 m RNA表达(P<0.05)。归因分析发现,La_(2)(SO_(4))_(3)和LaCl_(3)的La^(3+)均能诱导Hep G2细胞上述8个基因m RNA表达上调(P<0.05),但对CYP1A1,CYP3A5,DUSP4和CYP17A1m RNA表达的诱导作用低于La_(2)(SO_(4))_(3)(P<0.05),对CYP3A5和RASGRF1 m RNA表达的诱导作用低于LaCl_(3)(P<0.05);La(NO_(3))_(3)的La^(3+)虽能诱导上述8个基因m RNA表达上调,但ANPEP m RNA的表达上调无统计学意义,且对CYP3A5和CYP17A1 m RNA表达的诱导作用低于La(NO_(3))_(3)(P<0.05)。此外,3种镧盐的La^(3+)对ANPEP,OSBPL7,CYP3A5,CACNG4,DUSP4,RASGRF1和CYP17A1等7个基因m RNA表达的诱导作用彼此间亦存在差异(P<0.05)。结论La^(3+)与酸根离子SO_(4)^(2-),Cl^(-)和NO_(3)^(-)均可诱导Hep G2细胞特定基因m RNA表达的改变,La_(2)(SO_(4))_(3),LaCl_(3)和La(NO_(3))_(3)对Hep G2细胞基因m RNA表达的影响是La^(3+)与酸根离子SO_(4)^(2-),Cl^(-)和NO_(3)^(-)共同作用的结果,不应仅归因于La^(3+)。

一氧化氮供体药物硝普钠的遗传毒性的研究

本文以硝普钠（ＳＮＰ）为ＮＯ供体药物，研究慢性升高的ＮＯ对哺乳动物细胞的诱变作用和微核形成的影响。结果ＳＮＰ（２－８ｍＭ，不加或加Ｓ９）处理，均以剂量—反应方式诱发ｇ１２细胞ｇｐｔ位点突变，在最高受试剂量，诱变率分别超过本底１３和２５倍。在处理组还观察到含微核的双核细胞数显著增多。在０．５－４ｍＭ（＋Ｓ９）或２－８ｍＭ（－Ｓ９）ＳＮＰ剂量范围内，双核微核细胞率、微核率及含多微核的双核细胞比率均以剂量—依存方式增加。结果表明ＳＮＰ释放的ＮＯ过量积累可能是导致ｇ１２细胞遗传毒性的主要原因。

外周血单个核细胞线粒体功能失调作为锰神经毒性早期效应标志的人群研究

目的探讨以外周血单个核细胞线粒体功能失调作为锰神经毒性早期效应标志的可能性。方法选取已脱离锰接触的锰中毒病人18名作为中毒脱离接触组,选取锰作业工人73名作为锰接触组,选取无职业性锰接触人群63名作为对照组,对锰作业现场进行劳动卫生学监测,对中毒脱离接触组、接触组及对照组人群进行一般健康状况及神经系统检查,并对接触组和对照组进行神经行为功能核心组合测试(NCBT),检测3组人群外周血单个核细胞线粒体功能(呼吸控制率、ATP生成、线粒体膜电位),并对接触组神经行为指标与线粒体功能失调进行相关性分析。结果锰作业现场中拌粉机旁及其二层投料口粉尘浓度严重超标,高达16.3和38.0 mg/m3,分别超标1.63和3.8倍(卫生标准为10 mg/m3,TJ36-79),其中MnO2浓度为0.84和1.51 mg/m3,超标4.2和7.6倍(卫生标准为0.2 mg/m3,TJ36-79);一般健康状况及神经检查发现,中毒脱离接触组和接触组均有头晕、头痛、记忆力减退、注意力分散等植物神经紊乱等症状,中毒脱离接触组中有震颤及共济运动失调等锥体外系损害体征,接触组未见锥体外系神经系统损害体征;接触组与对照组NCBT神经行为功能检测发现,接触组易出现疲倦感,简单反应时较对照组显著增加,数字跨度、视觉记忆和目标追踪试验与对照组比较,差异有统计学意义;接触组血单个核细胞线粒体功能指标RCR、ATP生成及线粒体膜电位较对照组均显著降低,差异均有统计学意义(P<0.05),而中毒脱离接触组与对照组比较,差异无统计学意义(P>0.05);相关分析表明,接触组简单反应时、数字跨度与线粒体功能指标改变具有相关性(P<0.05或P<0.01)。结论锰接触可导致外周血单个核细胞线粒体功能失调,对于锰接触者外周血单个核细胞线粒体功能失调可作为潜在的锰神经毒性早期效应生物标志。

模拟一次快速静脉注射和静脉滴注体外染毒模型的构建

目的以硝酸镧La(NO_(3))_(3)为受试物,构建模拟一次快速静脉注射和静脉滴注2种体外染毒模型。方法自主设计由储液室、染毒室和废液室组成的染毒装置,由蠕动泵软管连接各室以实现液体单向和定速传输。根据预设的毒代动力学参数,构建模拟一次快速静脉注射和静脉滴注的体外染毒模型。以电感耦合等离子体质谱仪(ICP-MS)测定不同时间点染毒室中La(NO_(3))_(3)含量。利用PKsolver和GraphPad Prism 7软件对La(NO_(3))_(3)浓度-时间曲线进行分析,通过比较毒代动力学参数实测值和理论值对2种染毒模型进行评估。结果2种体外染毒模型的消除速率常数、半衰期、清除率和曲线下面积等参数实测值均与理论值接近,拟合系数R^(2)均>0.9900。结论由蠕动泵连接储液室、染毒室和废液室组成的染毒装置可体外模拟一次快速静脉注射和静脉滴注2种染毒模型。本研究为优化体外毒性测试染毒方法提供了初步实验依据,对基于体外毒性测试的化学品风险评估具有一定理论和实际意义。

锰中毒和PD模型小鼠神经行为改变及损伤部位的比较研究

目的探讨锰中毒和PD模型小鼠神经行为学及组织病理学的异同，为锰中毒的诊断和防治提供依据。方法成年C57BL/6雄性小鼠共80只，随机分为5组，每组16只，MnCl2低、中、高剂量组分别腹腔注射5、10、20 mg/kg MnCl2，PD模型组腹腔注射30 mg/kg MPTP，对照组注射等量生理盐水，5次/周，连续4周，每天观察动物一般情况。注射结束1周后，通过爬杆实验、旷场实验、水迷宫实验检测小鼠平衡协调能力、焦虑抑郁状态以及学习记忆等神经行为学改变；处死动物，显微镜下观察纹状体及黑质H-E染色病理切片，检查神经细胞病理变化。结果与对照组比较，MnCl2高剂量组小鼠体重明显降低，差异有统计学意义（P〈0.01）。与对照组比较，MnCl2和MPTP组小鼠爬杆实验总时间和转身时间明显增加差异均有统计学意义（P〈0.05），MnCl2中、高剂量组和MPTP组小鼠旷场实验穿过格子数、站立次数以及中央场活动时间明显减少（P〈0.05），MnCl2高剂量组及MPTP组小鼠水迷宫实验逃避潜伏时间增加且目标象限活动时间减少，差异均有统计学意义（P〈0.05）。与MPTP组比较，MnCl2高剂量组逃避潜伏时间明显增加，差异有统计学意义（P〈0.05）；病理结果显示，与对照组比较，MnCl2及MPTP组嗜酸性水平增高，其中纹状体嗜酸性细胞数MnCl2高剂量组高于MPTP组，差异有统计学意义（P〈0.01），黑质嗜酸性细胞MnCl2组少于MPTP组，差异有统计学意义（P〈0.01）。结论锰和MPTP均可引起多巴胺能神经系统损伤，锰中毒导致的神经行为学改变及损伤部位与MPTP诱导的PD模型不完全一致。

苯并[a]芘恶性转化细胞T-16HBE-C1与非转化细胞16HBE基因表达谱差异分析

目的比较苯并[a]芘(BaP)恶性转化细胞T-16HBE-C1与非转化细胞16HBE全基因组表达谱差异,为进一步阐明BaP致癌机制和筛选BaP致癌生物学标志提供线索。方法选择BaP恶性转化细胞T-16HBE-C1与非转化细胞16HBE作为BaP致癌机制研究模型,利用人全基因组表达谱芯片Human mRNA OneArray?HOA v7 Microarrays筛选细胞间差异表达基因。继而对差异表达基因进行生物信息学分析,包括利用DAVID数据库对差异表达基因进行GO分析和KEGG通路分析。结果人全基因组表达谱芯片共发现689个基因在T-16HBE-C1和16HBE细胞中表达差异在2倍以上(P<0.05),其中339个基因在T-16HBE-C1细胞中的表达高于16HBE细胞,350个基因在T-16HBE-C1细胞中的表达低于16HBE细胞。差异表达基因涉及多种生物学改变,主要包括肿瘤信号转导、细胞增殖与凋亡、细胞代谢和细胞黏附等。结论人支气管上皮16HBE细胞经BaP恶性转化后基因表达谱发生明显改变,差异表达基因可能在BaP致癌中发挥作用,并可能作为BaP致癌的潜在生物学标志。

ALCAM基因敲除对苯并[a]芘恶性转化细胞THBEc1转录组的影响

目的检测活化白细胞黏附分子(ALCAM)基因敲除后苯并[a]芘(BaP)恶性转化细胞THBEc1转录组的改变,探究ALCAM在BaP致癌中的作用,为进一步阐明BaP致癌机制提供线索。方法选择两株ALCAM基因纯合敲除THBEc1细胞THBEc1-ΔALCAM-c5和THBEc1-ΔALCAM-c7及一株敲除对照细胞THBEc1-ctrl作为模型,利用转录组测序技术筛选细胞间差异表达基因,使用DAVID数据库对差异表达基因进行GO分析和KEGG通路富集分析。利用克隆形成实验检测ALCAM敲除对THBEc1细胞增殖的影响。结果转录组测序共发现336个基因在两株ALCAM敲除THBEc1细胞和THBEc1-ctrl细胞中表达差异在2倍以上(FDR<0.05),其中62个基因在两株ALCAM敲除THBEc1细胞中的表达低于THBEc1-ctrl细胞,274个基因在两株ALCAM敲除THBEc1细胞中的表达高于THBEc1-ctrl细胞。差异表达基因涉及多种生物学功能,主要包括细胞增殖、迁移、黏附、信号转导、凋亡、血管生成、炎症反应和免疫应答等。克隆形成实验证实ALCAM敲除可降低THBEc1细胞增殖能力。结论敲除ALCAM后BaP恶性转化细胞THBEc1转录组明显改变,增殖能力明显降低。ALCAM可能在BaP致癌中发挥重要作用,并可能作为BaP致癌的潜在生物标志物。