人眼虹膜色素上皮细胞的培养与鉴定

目的 :观察体外培养的人眼虹膜色素上皮细胞(irispigmentepithelium ,IPE)的生长状况 ,用透射电镜、细胞免疫化学实验鉴定其性质 ,为进一步研究IPE细胞生理、病理作用提供模型。方法 :对来源于不同个体的健康人眼采用酶消化加显微分离法 ,分离IPE细胞 ,对其进行培养、传代、冻存和复苏。用透射电镜、细胞免疫化学法鉴定细胞性质。建立IPE细胞的有限细胞系。结果 :原代培养的IPE呈棕黑色多角形或不规则形 ,2 4h内 73%细胞贴壁。贴壁细胞体积变大呈多边形或方形 ,胞核轮廓变清 ,胞浆内充满黑色素颗粒。分裂增殖生长的细胞色素颗粒逐渐减少 ,4～ 6代后细胞内色素随着不断分裂逐渐减少至消失 ,部分形态变为成纤维细胞状。电镜下可见细胞表面有丰富的微绒毛 ,胞浆内含少量色素颗粒。细胞免疫化学抗角蛋白与抗S 10 0染色显示IPE细胞胞质呈鲜红色着色。结论 :采用酶消化加显微分离法可以建立人IPE的有限细胞系。

碱性成纤维细胞生长因子和转化生长因子-β对人巩膜成纤维细胞的生长调控研究

目的研究碱性成纤维细胞生长因子(basic fibrob-last growth factor,bFGF)和转化生长因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)对人巩膜成纤维细胞的生长调控,进一步明确bFGF和TGF-β影响近视的作用部位及可能机制。方法取角膜移植后的3只健康供体眼球,分离培养巩膜成纤维细胞并建立细胞系,取第3～5代生长良好的细胞,在培养液中分别加入1ng/ml、3ng/ml、10ng/ml、30ng/ml、100ng/ml、300ng/ml的bFGF以及0.1ng/ml、0.3ng/ml、1ng/ml、3ng/ml、10ng/ml、30ng/ml的TGF-β,两组均设空白对照。6d后进行细胞计数,选用t-test进行统计分析。每株细胞重复3次,共重复3株细胞,观察bFGF和TGF-β对巩膜成纤维细胞的生长调控作用。结果bFGF能明显促进人巩膜成纤维细胞的生长,随浓度增加呈明显剂量效应关系。bFGF大于10ng/ml时(包括10ng/ml),和无bFGF的正常培养液比较,差异具有显著性(P<0.05)。TGF-β能明显抑制人巩膜成纤维细胞的生长,抑制细胞生长的作用亦呈明显的剂量效应关系。TGF-β大于0.3ng/ml时(包括0.3ng/ml),和无TGF-β的正常培养液比较,差异具有显著性(P<0.05)。结论本实验结果显示,bFGF对人巩膜成纤维细胞生长具有明显促进作用,而TGF-β则表现为明显抑制作用。进一步证实外源性bFGF和TGF-β可能作用于巩膜组织,并通过调控巩膜成纤维细胞的生长及巩膜细胞外基质合成代谢单独或协同作用参与巩膜重塑过程。

苦参碱对人宫颈癌Hela细胞的增殖抑制作用研究

目的探讨苦参碱对人宫颈癌细胞株Hela细胞体外增殖的抑制作用。方法选用人宫颈癌Hela细胞进行体外培养,以0.25～4.0mg/ml的苦参碱分别处理Hela细胞24～72h后,用MTT法检测细胞生长抑制率,流式细胞仪检测细胞凋亡率,倒置显微镜和透射电镜进行形态学观察。结果苦参碱对Hela细胞有抑制作用,并呈剂量和时间依赖性;流式细胞仪检测到细胞在苦参碱作用后,细胞凋亡率增加;透射电镜观察发现部分细胞发生凋亡早期改变。结论苦参碱对人宫颈癌Hela细胞具有明显抑制作用,诱导细胞凋亡可能是其机制之一。

白介素1受体拮抗剂对兔实验性增生性玻璃体视网膜病变的抑制作用

目的 :评价白细胞介素 1受体拮抗剂 (IL 1recep toranti gonist,IL 1Ra)对实验性增生性玻璃体视网膜病变(proliferativevitreoretinopathy ,PVR)的抑制作用。方法 :32只兔眼分为对照组、IL 1Ra组、地塞米松组和联合用药组 (每组 8眼 ) ,将 2 .5× 10 5个视网膜色素上皮细胞 (retinalpigmentep ithelium ,RPE)注入玻璃体腔内建立PVR模型 ,各组分别给予IL 1Ra和地塞米松并联合用药 ,观察PVR的形成 ,计算各组PVR的发生率。结果 :第 4周末对照组 10 0 %发生视网膜脱离 ,IL 1Ra组 6 2 .5 %发生视网膜脱离 ,地塞米松组有 5 0 .0 %发生视网膜脱离 ,而联合用药组 2 5 .0 %发生牵拉性视网膜脱离。联合用药组比所有其他组的视网膜玻璃体病变轻 ,视网膜脱离的面积也较小。结论 :IL 1Ra可以降低兔实验性PVR的发生率 ,IL 1Ra与地塞米松联合应用能够增加地塞米松的作用效果。

三种基因导入系统对视网膜色素上皮细胞转染效率的研究

目的 :以增强型绿色荧光蛋白 (enhancedgreenflu orescentprotein ,EGFP)为报告基因 ,研究lipofectamine 2 0 0 0、Fu GENE6和逆转录病毒载体介导的基因导入系统对视网膜色素上皮细胞的基因转染效率 ,为视网膜及视网膜相关疾病的基因治疗奠定基础。方法 :在体外分离培养人视网膜色素上皮细胞 ,构建含有EGFP基因的表达载体 ,分别应用阳离子脂质体lipofectamine 2 0 0 0、FuGENE6和逆转录病毒三种方法将EGFP基因转染到人视网膜色素上皮细胞中 ,转染后于 4 8h在荧光显微镜下观察EGFP的表达情况。结果 :三种方法介导EGFP基因在人视网膜色素上皮细胞中表达的阳性比例平均分别为 5 2 %、10 %和 72 %。结论 :在体外可通过逆转录病毒系统或阳离子脂质体lipofectamine 2 0 0 0有效地将外源基因导入到人视网膜色素上皮细胞中 ,其中以逆转录病毒系统转染效率为最高。

杆状病毒介导LacZ基因转染体外培养的人虹膜色素上皮细胞(英文)

目的 :研究重组杆状病毒 (baculovirus)载体介导 β 半乳糖苷酶基因 (LacZ)对体外培养虹膜色素上皮(IPE)细胞的转染和表达情况。方法 :将质粒pCMV β中的CMV LacZ表达盒插入杆状病毒表达载体pFastBacI的EcoRI/HindⅢ位点 ,构建重组质粒pBac β ,并利用Bac to Bac表达系统在Sf9细胞中产生出重组杆状病毒BV β。将MOI为 2 0 0的BV β感染经酶消化加显微法分离培养的IPE细胞 ,2 4h后进行X gal染色。在显微镜下观察IPE中LacZ表达阳性的情况 ,记录阳性细胞所占的百分比。结果 :限制性酶切分析及测序结果表明 ,我们已成功构建表达质粒pBac β及重组杆状病毒BV β。X gal染色证实杆状病毒介导LacZ在细胞中的表达呈蓝色 ,弥漫于整个胞浆。感染后 2 4h时表达阳性率达 85 %。结论 :重组杆状病毒可有效介导报告基因在体外培养的IPE细胞中表达 ,为利用杆状病毒构建可供移植的基因工程化虹膜色素上皮细胞提供了实验依据。

医院科研档案规范化管理探讨

文章详细阐述了医院科研档案管理的重要性,并对如何规范管理科研档案进行了探讨。

碱性成纤维细胞生长因子和转化生长因子β受体在人巩膜成纤维细胞内的表达

目的 了解人眼巩膜成纤维细胞是否表达碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)受体FGFR1和转化生长因子(TGF- β)受体TβRⅠ和TβRⅡ。方法 角膜移植后的4只眼球,应用定点解剖及游走促进法进行巩膜成纤维细胞的分离培养,建立细胞系,采用免疫荧光染色法检测bFGF受体FGFR1和TGF- β受体TβRⅠ和TβRⅡ蛋白的表达。结果 分别应用FGFR 1、TβRⅠ和TβRⅡ的特异多克隆抗体染色,整个细胞表面或细胞核周呈现特异性黄绿色荧光,受体位于细胞胞膜上。肉眼观察TβRⅠ和TβRⅡ呈强阳性表达,FGFR 1表达较弱于TβRⅠ和TβRⅡ。结论 人巩膜成纤维细胞表达bFGF受体FGFR1和TGF β受体TβRⅠ、TβR的功能性蛋白,巩膜是bFGF和TGF- β发挥作用的一个部位。外源的bFGF和TGF -β通过与巩膜成纤维细胞上的上述相应受体结合发挥作用,是影响实验性近视发生发展的机制之一。

毒蕈碱1型受体在人视网膜色素上皮细胞表达的研究

目的探讨正常人眼视网膜色素上皮(RPE)细胞毒蕈碱1型(M1)受体的表达情况和M1受体对维持RPE细胞功能的作用及其与近视发生、发展的关系。方法采用已建立的RPE细胞的分离和培养方法建立细胞培养株。取传3~5代生长良好的细胞,应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)、间接免疫荧光法(IIF)检测培养的RPE细胞中M1受体的表达情况。结果培养的RPE细胞呈多边形,平均分裂时间约2~3d,细胞内含有棕黄色素颗粒,随着细胞的分裂,细胞内的色素颗粒稀释和变少。RT-PCR和间接免疫荧光法检测,显示体外培养的人RPE细胞有M1受体表达。结论人RPE细胞有M1受体的分布。M1受体对维持RPE细胞的功能起重要作用。M1受体拮抗剂玻璃体腔注射以延缓近视的发生、发展机制可能与其抑制RPE细胞功能有关。

毒蕈碱受体Ⅰ型受体在人眼巩膜成纤维细胞中的表达

目的探讨正常人眼巩膜成纤维细胞毒蕈碱受体Ⅰ型(M1)受体的表达与近视发生发展之间的关系.方法应用定点解剖及游走促进法分离培养人巩膜成纤维细胞,取3～5代生长良好的细胞,运用RT-PCR、间接免疫荧光试验检测培养的巩膜成纤维细胞中M1受体的表达;并制作巩膜组织的冷冻切片,以免疫组化法检测巩膜组织中巩膜成纤维细胞上M1受体亚型的表达.结果培养的巩膜成纤维细胞呈双极型或纺锤形,平均分裂时间为2～3 d左右,细胞生长旺盛,近融合时细胞呈规则排列的纺锤形.RT-PCR和间接免疫荧光试验结果显示体外培养的人巩膜成纤维细胞表达M1受体.组织免疫组化法结果显示巩膜组织中的成纤维细胞表达M1受体.结论人巩膜成纤维细胞具有M1受体的分布.巩膜上M1受体的存在预示着M1受体拮抗剂延缓近视的发生发展的作用部位可能是位于巩膜上,而巩膜上的M1受体可能参与了近视的眼轴延长及近视屈光度的改变.(中华眼科杂志,2005,41:995-999)

黄色人种葡萄膜黑色素细胞的体外培养及其色素合成研究

目的 探讨体外培养黄色人种脉络膜、虹膜黑色素细胞的可行性 ,并观察黑色素细胞能否在体外培养时合成色素。方法 将除去色素上皮细胞的脉络膜、虹膜基质组织用胰酶与胶原酶消化 ,分离得到的细胞用添加胎牛血清、碱性成纤维细胞生长因子、异丁基甲基黄嘌呤、霍乱毒素的F12培养液培养。用角蛋白抗体、S 10 0抗体进行细胞免疫组化染色。用分光光度计测定细胞内黑色素含量并计算其生成量。结果 成功体外培养了葡萄膜黑色素细胞 ;生长期每个黑色素细胞内的平均色素含量为 (79 83± 36 2 0 ) pg ,每个细胞每天合成黑色素 (11 4 4± 5 77) pg ,体外培养的葡萄膜黑色素细胞S 10 0表达阳性 ,但角蛋白表达阴性。结论 体外培养的黄色人种葡萄膜黑色素细胞能在体外合成色素 ,黄色人种葡萄膜黑色素细胞内的色素含量与制造量介于白色人种和黑色人种之间。